HPLC‐HRMS‐basierte Metabolomics‐Studien: Vergleich von pathogenen und nicht pathogenen E. coli‐Stämmen und Identifizierung von Biomarkern für den Paprikaverzehr in Humanurin

Zusammenfassung Die Anwendung von Metabolomics, d.h. die Analyse des Metaboloms, gewinnt immer mehr an Bedeutung und kann für verschiedene Bereiche eingesetzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Metabolomics‐Studien mit unterschiedlichen Fragestellungen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC) gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (high‐resolution mass spectrometry, HRMS) durchgeführt. Die nach der HPLC‐HRMS‐Analyse erhaltenen, großen und komplexen Datensätze wurden im Anschluss mittels MZmine 2 prozessiert, um Feature‐Listen basierend auf dem Masse‐ zu‐Ladungs‐Verhältnis (m/z), der Retentionszeit und der Peakfläche zu erhalten. Diese Listen wurden miteinander kombiniert und im Anschluss durch die Anwendung statistischer Analysen verglichen. Dieser Vergleich erfolgte anhand der Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis , PCA) und der fold change (FC)‐Analyse mit kombiniertem t‐Test (visualisiert durch den volcano‐Plot). Die zur Metabolom‐Unterscheidung beitragenden, diskriminierenden Features wurden im Hinblick auf die Identifizierung der jeweiligen Metaboliten weiter untersucht. Dazu erfolgte die Metaboliten‐Identifizierung anhand von massenspektrometrischer Analyse mittels exakter Masse, Isotopenmuster und Fragmentierungsverhalten sowie nach Isolierung mittels Kernspinresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance , NMR). In der ersten durchgeführten Studie erfolgte eine Exometabolom‐Analyse der drei E. coli‐Stämme Nissle 1917 (EcN), 83972 und CFT073. Diese drei Stämme sind genetisch eng verwandt, zeigen allerdings sehr unterschiedliche phänotypische Eigenschaften. Bei EcN handelt es sich um einen fäkalen, nicht‐pathogenen E. coli‐Stamm, der auch als Probiotikum bei verschiedenen Magen‐DarmErkrankungen Anwendung findet. Der ebenfalls nicht‐pathogene E. coli ‐Stamm 83972 ist in der Lage, die menschliche Blase effizient zu besiedeln, allerdings ohne die Auslösung von Symptomen einer Harnwegsinfektion (asymptomatische Bakteriurie, ABU). Der dritte E. coli‐Stamm C f T073 ist ein hochvirulenter uropathogener E. coli (UPEC)‐Stamm, der bis hin zu einer akuten Pyelonephritis (Nierenbecken‐entzündung) führen kann. Das Ziel dieser Studie lag in der Identifizierung von extrazellulären Metaboliten, die zur Unterscheidung der unterschiedlichen Phänotypen beitragen. Die Anzucht der Stämme erfolgte in drei biologischen Replikaten in einem definierten, minimalen Kulturmedium bei 37 °C für 6 h als statische Kulturen. Zur HPLC‐HRMS‐Analyse wurden anschließend die sterilen Kulturüberstände verwendet. Der Metabolom‐Vergleich zeigte signifikante Unterschiede des Metaboloms von EcN im Vergleich zum Metabolom von E. coli 83972 und CFT073. Ein wesentlich geringerer Unterschied wurde zwischen dem Metabolom von E. coli CFT073 und 83972 beobachtet. Die Analyse der diskriminierenden Features zeigte, dass vor allem die zwei Siderophor‐Systeme Aerobactin und Yersiniabactin (Ybt) für die Unterscheidung der Metabolome verantwortlich waren. Siderophore dienen als Chelatbildner zur Aufnahme von Eisen aus der Umwelt, welches essentiell für das Bakterienwachstum ist. Vor allem Ybt sowie verschiedene detektierte Ybt‐Strukturderivate scheinen hier eine große Rolle zu spielen, weshalb sich im weiteren Verlauf der Arbeit hauptsächlich auf diesen Siderophor fokussiert wurde. Diese Metaboliten wurden hauptsächlich im Metabolom von EcN detektiert und in wesentlich geringeren Mengen im Metabolom von E. coli 83972. Im Gegensatz dazu ist E. coli CFT073 aufgrund von Mutationen nicht zur Ybt‐Produktion in der Lage. Daher wird der signifikante Unterschied des Metaboloms von EcN im Vergleich zu den anderen beiden Stämmen unter anderem auf diese Metaboliten zurückgeführt. Für diese stark unterschiedlichen Produktionsmengen von Ybt und seinen Derivaten von EcN und E. coli 83972 wird das unterschiedliche Wachstumsverhalten der Bakterien als eine mögliche Begründung angenommen. E. coli 83972 zeigte nach der Kultivierung im minimalen Medium die stärkste Biofilmbildung, wodurch womöglich weniger Metaboliten an das Medium abgegeben wurden. Eine zusätzliche Kultivierung in Humanurin zeigte ein verändertes bakterielles Wachstum sowie eine veränderte Ybt‐Produktion und bestätigte den in der Fachliteratur ebenfalls beschriebenen Einfluss des Mediums auf das bakterielle Wachstum. Bei den Ybt‐Derivaten wurde basierend auf einer massenspektrometrischen Analyse neben den Metallkomplexen Fe(NI)‐Ybt und Cu(N)‐Ybt das bekannte und physiologisch relevante Ybt‐Derivat Escherichelin sowie zwei bisher unbekannte Ybt‐Derivate, hier als 1‐A und 2 A bezeichnet, identifiziert. Des Weiteren wurde Ulbactin B, welches bislang nur aus marinen Bakterien bekannt ist, nach der Isolierung aus Kulturüberständen von EcN mittels NMR‐Spektroskopie bestätigt. Dadurch wurde zum ersten Mal die Produktion von Ulbactin B durch E. coli ‐Stämme gezeigt. Neben den aus der Metabolomics‐Studie neu detektierten Ybt‐Derivaten 1‐A und 2 A wurden nach der HRMS‐ Analyse des aufkonzentrierten Kulturüberstands von EcN noch weitere, unbekannte Ybt‐Derivate (1‐B, 2‐B, 3‐A/‐B bis 6 A/‐B und 7‐A1‐3) nachgewiesen. Diese kamen größtenteils in zwei isomeren Formen vor, die anhand ihres Fragmentierungsverhalten in A‐ und B‐Isomere eingeteilt wurden (Ausnahme Derivat 7, hier drei isomere Formen A). Die isomere Form A zeigte im Vergleich zum B Isomer den gleichen, für Ybt typischen Neutralverlust (NL) von 187 Da als Hauptfragment. Mittels einer ausführlichen HRMS‐Analyse und des Vergleichs der verschiedenen Fragmentspektren mit denen von Ybt, wurden die Derivate weiter charakterisiert und die mögliche Struktur weiter eingegrenzt (s. Abbildung 1). Anhand dieser Analyse wird vermutet, dass die jeweiligen A‐ und B‐ Isomere der Derivate 1 bis 6 die gleiche Art an Substituent im Vergleich zu Ybt besitzen, welcher an der Ybt‐Grundstruktur an unterschiedlichen Positionen, die zum Teil weiter eingegrenzt wurden, gebunden vorliegt. So wird als an der Ybt‐Grundstruktur gebundener Substituent für die beiden isomeren Formen (A und B) für das Derivat 1 eine OH‐Gruppe, für die Derivate 2 und 5 (Unterschied liegt wahrscheinlich in einer fehlenden CH3‐Gruppe) eine Cystein‐Seitenkette, für das Derivat 3 eine methylierte CysteinSeitenkette, für das Derivat 4 eine über eine Disulfidbrücke gebundene Cystein‐Seitenkette und für das Derivat 6 eine zusätzliche OH‐ sowie SH‐Gruppe vermutet. Das Derivat 7 stellte mit seinen drei isomeren Formen A eine Ausnahme dar. Hier war eine weitere Eingrenzung oder Charakterisierung bezüglich einer möglichen Struktur oder der Art der Modifikation (ob modifizierte Grundstruktur oder Seitenkette) nur basierend auf massenspektrometrischer Analyse nicht möglich. In der zweiten durchgeführten Metabolomics‐Studie lag das Ziel in der Identifizierung von ernährungsbedingten Biomarkern für den Paprikaverzehr in Humanurin. Die Ernährung wird häufig mit der Gesundheit und Vorbeugung von Krankheiten in Zusammenhang gebracht. Um diesen Zusammenhang zu untersuchen sind zuverlässige Daten erforderlich. Daher gewinnen Biomarker für eine objektive Bewertung des Ernährungsstatus immer mehr an Bedeutung. Da allgemein Paprika (Caps/cum L.), welche als Gewürz oder Gemüse Verwendung finden, eine der wichtigsten Gemüsesorten in der menschlichen Ernährung darstellen und bisher noch keine Biomarker für diese beschrieben wurden, sollten im Rahmen dieser Arbeit Biomarker für den Verzehr von Gemüsepaprika identifiziert werden. Hierzu wurde eine zweiphasige Ernährungsinterventionsstudie mit 14 Probanden durchgeführt, in der Aliquote der Urinabgaben über einen bestimmten Zeitraum für die anschließende HPLC‐HRMS‐Analyse gesammelt wurden. In der ersten Phase verzichteten die Probanden komplett auf den Verzehr von Paprika sowie von sämtlichen Paprikaprodukten (Kontrollgruppe). Daraufhin verzehrten die gleichen Probanden in der zweiten Phase nach einem ebenfalls strikten Paprikaverzicht einmalig eine definierte Menge an frischer, roter Gemüsepaprika (Fallgruppe). Der anschließende Vergleich der Urin‐Metabolome der Kontroll‐ und Fallgruppe zeigte signifikante Unterschiede, die auf den Paprikaverzehr zurückgeführt wurden. Die statistische Analyse ergab zahlreiche diskriminierende Features, welche zur weiteren Betrachtung als potentielle Biomarker berücksichtigt wurden. Nachdem einige dieser Features zur weiteren Analyse ausgewählt wurden, wurden insgesamt acht glucuronidierte Metaboliten als potentielle Biomarker identifiziert. Insgesamt wurden die Strukturen von sieben Metaboliten mittels NMR‐Spektroskopie aufgeklärt, nachdem diese aus Humanurin isoliert wurden (s. Abbildung 2). Anhand der Aglycone wurden Annahmen zu potentiellen Vorläufersubstanzen gemacht, bei denen es sich um, für Capsicum‐Früchte typische, Sekundärmetaboliten handelt. Einer der potentiellen Biomarker, 3‐O‐ß‐D‐Glucopyranosyl‐uronsäure‐7,8‐dihydro‐apo‐9‐capsorubinon (B‐1), wird als modifiziertes Apocarotinoid angenommen, welches womöglich von den Hauptcarotinoiden (Capsanthin, Capsorubin und Capsanthin‐5,6‐epoxid) der roten Capsicum‐Früchte oder von weiteren Capsanthin‐Derivaten bzw. Apocarotinoiden aus den Früchten abstammt. Die restlichen potentiellen Biomarker werden als mögliche Spaltprodukte von Capsianosiden angenommen, bei denen aufgrund struktureller Ähnlichkeiten der verschiedenen Capsianoside eine Vielzahl an Vorläufern in Frage kommen können. Bei 19‐O‐ß‐D‐Glucopyranosyl‐uronsäure‐10,11‐dihydro‐6Z‐ apo‐12‐geranyllinalool‐12‐säure (B‐2) und den beiden isomeren Formen 19‐O‐ß‐D‐Glucopyranosyl‐ uronsäure‐6Z,10E‐apo‐14‐geranyllinalool‐14‐säure (B‐4a) und 19‐O‐ß‐D‐Glucopyranosyl‐ uronsäure‐10,11‐dihydro‐6Z,11E‐apo‐14‐geranyllinalool‐11‐en‐14‐säure (B‐4b) liegt die Glucuronsäure‐Einheit an der gleichen Position (C‐19) gebunden vor und es wird ein vergleichbarer Metabolismus zur Bildung der drei Metaboliten vermutet. Für die beiden potentiellen Biomarker B‐ 5a und B‐5b, welche die Glucuronsäure‐Einheit an einer anderen Position (C‐3) am Aglycon gebunden haben, wird angenommen, dass es sich um Diastereomere handelt. Die Daten geben Hinweise darauf, dass sich die beiden Metaboliten in der Konfiguration an C‐13 oder C‐15 unterscheiden und wurden daher als 3 O ß‐D‐Glucopyranosyl‐uronsäure‐14,15‐dihydro‐13(R/S)‐ hydroxy‐15(R/S)‐6E,10E‐geranyllinalo‐ol‐16‐säure beschrieben. Dahingegen wurde 13‐O‐ß‐D‐ Glucopyranosyl‐uronsäure‐1,2‐dihydro‐1,2‐dihydroxy‐6E,10E‐apo‐13‐geranyllinalool‐13‐ester (B‐ 3a) als Acylglucuronid identifiziert, das ebenfalls eine weitere isomere Form aufweist (hier als B 3b bezeichnet), dessen Struktur nicht weiter aufgeklärt werden konnte. Im Anschluss erfolgte nach einer ausführlichen Methodenvalidierung die Quantifizierung der potentiellen Biomarker in den Urinproben der Fall‐ und Kontrollgruppe mittels HPLC gekoppelt mit Tandem‐Massenspektrometrie (m S / MS ) zur Bestimmung der jeweiligen Urin‐Ausscheidung. Hier zeigten alle potentiellen Biomarker nur in den Urinproben der Fallgruppe einen deutlichen Anstieg der Biomarker‐Konzentration, sodass auf einen Zusammenhang zwischen dem Paprikaverzehr und der Ausscheidung geschlossen wurde. Bei wenigen Blindproben der Fall‐ und Kontrollgruppe, bei denen es sich um den Morgenurin nach einer zweitägigen Auswasch‐Phase handelte, sowie bei einigen weiteren Urinproben der Kontrollgruppe wurden die potentiellen Biomarker B‐3a, B‐3b, B‐5a und B 5b detektiert. Dies wurde jedoch größtenteils auf die lange Ausscheidungsdauer der jeweiligen Metaboliten zurückgeführt, könnte allerdings auch erste Hinweise auf eine mögliche interindividuelle, unterschiedlich lange Ausscheidung geben. B‐1 zeigte im Vergleich zu den übrigen potentiellen Biomarkern die schnellste Urin‐Ausscheidung, die in dem Zeitraum von 2‐4 h nach Paprikaverzehr ihr Maximum hatte. Ein signifikanter Unterschied im Vergleich zu den Blindproben lag bis einschließlich zum Zeitraum 12‐14 h nach Paprikaverzehr vor. Die Urin‐Ausscheidungen von B‐2, B‐4a und B 4b waren zueinander vergleichbar und zeigten ihr Maximum in dem Zeitraum von 6‐10 h (B‐2) bzw. 6‐8 h (B‐4a und B 4b) sowie einen signifikanten Unterschied bis einschließlich zum Zeitraum von 20 24 h nach Paprikaverzehr. Dahingegen ergab sich bei B‐3a, B‐3b, B‐5a und B 5b das Maximum der Ausscheidung in dem Zeitraum von 10‐12 h nach Paprikaverzehr. Signifikante Unterschiede traten bei B‐3a und B‐3b noch nach 20‐24 h und bei B‐5a und B 5b noch nach 48 h nach Paprikaverzehr auf, sodass wahrscheinlich alle diese vier potentiellen Biomarker länger als 48 h ausgeschieden werden. Durch diese Arbeit wird die Vielseitigkeit der Metabolomics‐Technologie, welche für verschiedene Bereiche und Fragestellungen eingesetzt werden kann, erneut belegt. Es zeigte sich, dass sich die Exometabolome der drei genetisch eng verwandten nicht‐pathogenen und pathogenen E. coli‐ Stämme EcN, 83972 und CFT073 unter den gewählten Anzucht‐bedingungen eher in den Produktionsraten als in unterschiedlichen Metaboliten an sich unterscheiden. Die hauptsächliche Detektion von Siderophoren deutet darauf hin, dass die Eisenaufnahme eine wichtige Rolle spielt. Des Weiteren wird gezeigt, dass Metabolomics eine sehr gute Technologie zur Identifizierung von ernährungsbedingten Biomarkern darstellt. Hier konnten mehrere potentielle Biomarker für den Paprikaverzehr identifiziert werden, bei denen es sich wahrscheinlich um Spaltprodukte von den Hauptcarotinoiden der roten Früchte (z.B. Capsanthin) sowie von verschiedenen Capsianosiden, die typisch für die Gattung Capsicum L. sind, handelt. Daher wird angenommen, dass es sich zum einen um potentielle Biomarker für die roten Capsicum‐Früchte (B‐1) und zum anderen um potentielle Biomarker für die gesamte Gattung Capsicum L. (B‐2, B‐3a/b, B‐4a/b, B‐5a/b) handelt.