日本鳗鲡TRAF3基因的克隆及功能研究

为探究鱼类TRAF3 在鱼类抗病毒免疫应答中的功能及作用机制,实验利用逆转录PCR克隆获得了日本鳗鲡 TRAF3 转录本(AjTRAF3),利用生物信息学软件分析了AjTRAF3 的结构特征,利用实时荧光定量PCR(qPCR)、双荧光素酶报告系统以及免疫共沉淀等方法对其表达规律、功能及作用机理进行了初步分析.AjTRAF3 的开放阅读框长度为 1707 bp,编码 568 个氨基酸.序列结构分析结果显示,AjTRAF3 由N端的环结构域 2个锌指结构域以及 1 个螺旋结构域和 C端高度保守的 TRAF-C(MATH)结构域组成.qPCR结果显示,AjTRAF3 在日本鳗鲡各组织中均有表达,脑组织中表达量最高,其次为头肾,心脏中的表达量最低.Poly I:C刺激 6h后,日本鳗鲡脾脏组织中AjTRAF3 上调倍数最高,为对照组的 15.83 倍.迟缓爱德华氏菌感染 24h后,日本鳗鲡脾脏组织中AjTRAF3 上调倍数最高,为对照组的 31.47 倍.此外,本研究构建了AjTRAF3 真核表达质粒,发现过表达AjTRAF3 能显著上调炎症及抗病毒相关基因的表达,可显著增强AjIFN2、AjIFN4 和NF-κB启动子荧光素酶活性.并能显著上调由AjRIG-IN、AjMAVS、AjIRF3 诱导的AjIFN2、AjIFN4 和NF-κB启动子活性.免疫荧光结果显示,AjTRAF3 主要定位于细胞质中,且与AjMAVS存在共定位.免疫共沉淀结果显示,AjTRAF3 通过MATH结构域与AjMAVS相互结合,缺失该结构域后,其与AjMAVS的相互作用消失,推测AjTRAF3 可通过介导RIG-I/MAVS信号转导途径调控鱼类的抗病毒免疫应答.本研究结果为进一步揭示鱼类TRAF3 的生物学功能奠定了基础.