Entwicklung massenspektrometrischer Methoden zur Analytik von Mykotoxinen in Innenräumen

Zusammenfassung Ein Schimmelpilzbefall tritt in Deutschland in etwa jeder zehnten Wohnung auf und kann gesundheitliche Beeinträchtigungen von Bewohnenden auslösen. Die Beschwerden reichen von Kopfschmerzen und Hautausschlägen über Asthmaerkrankungen bis hin zu Toxikosen. Auslöser und Wirkmechanismen sind dabei weitgehend unbekannt. Aufgrund ihres breiten Spektrums bioaktiver, toxischer und inflammatorischer Wirkungen wird in diesem Zusammenhang jedoch eine entscheidende Rolle sekundärer Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen (Mykotoxine) verstärkt diskutiert. Das Wissen bezüglich der menschlichen Exposition gegenüber Mykotoxinen im Innenraum ist bislang begrenzt, da die Erfassung dieser Substanzen in Schimmelpilz‐belasteten Wohnräumen nicht Teil von Routineuntersuchungen ist. Dies liegt zum einen in einer eingeschränkten Verfügbarkeit von Mykotoxin‐Referenzsubstanzen begründet und zum anderen an nur bedingt geeigneten und validierten Methoden zur Probenahme und Analytik. Zudem stellen die niedrigen Analytkonzentrationen und die komplex zusammengesetzten Untersuchungsmatrices im Innenraum große Herausforderungen für die instrumentelle Analytik dar. Zur Risikobewertung ist es notwendig, sowohl die Exposition gegenüber toxischen Sekundärmetaboliten als auch die Gefährdung, die von ihnen ausgeht, näher zu charakterisieren. Dies ist insbesondere aufgrund der ungenügenden Datenlage zum Vorkommen von Mykotoxinen in Innenräumen bislang nicht möglich. Das zentrale Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Entwicklung und Optimierung analytischer Methoden zum Nachweis von Mykotoxinen in Innenraummatrices. Als primäre Untersuchungsmatrix wurde dabei Hausstaub ausgewählt, da dieser als besonders geeignetes Medium zur Abschätzung menschlicher Langzeit‐Expositionen gilt. Zur Analyse wurde die nach einem zweistufigen Siebverfahren erhaltene Feinstaubfraktion mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser extrahiert und untersucht. Zunächst wurde dazu ein Screeningansatz basierend auf ultra‐hochleistungsflüssigchromatographischer Trennung gekoppelt mit Quadrupol‐ Flugzeitmassenspektrometrie (UHPLC‐QTOF‐HRMS) entwickelt. Die chromatographische Trennung der Analyten wurde auf einer Nucleodur C18 Gravity‐SB‐Säule unter Verwendung eines binären Gradienten aus Acetonitril und Wasser, jeweils mit einem Zusatz von 0,1% Ameisensäure, in einer kurzen Gesamtlaufzeit von 15 min erreicht. Die QTOF‐Detektionsmethode wurde zu Beginn für die Erfassung von 36 Mykotoxinen von Schimmelpilzen der Gattungen Alternaria, Aspergillus, Penicillium und Stachybotrys ausgelegt. Erste Untersuchungen Mykotoxin‐dotierter Hausstaubextrakte zeigten deutlich, dass der Eintrag von Matrixbestandteilen in das MS‐System zu immensen Signalsuppressionen führte und die Sensitivität des Nachweises stark einschränkte. Um auftretende Matrixeffekte zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu steigern, wurden sowohl Versuche zur Optimierung der Probenaufarbeitung als auch der chromatographischen und massenspektrometrischen Methoden durchgeführt. Der Einsatz elaborierter Probenvorbereitungsmethoden auf Basis von Festphasen‐ und Flüssig‐Flüssig‐Extraktionstechniken erwies sich diesbezüglich aufgrund von Interferenzen und zu hoher Selektivität als nicht zielführend. Ebenso führte der Einsatz einer alternativen Trenntechnik basierend auf der Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography , SEC) nicht zu einer verringerten Signalsuppression. Lediglich die Ergänzung einer 1:10‐Verdünnung der Hausstaubextrakte in Verbindung mit einer Erhöhung des Injektionsvolumens von 5 pL auf 30 pL führte insgesamt zu einer Sensitivitätssteigerung. Durch die Optimierung Analyt‐spezifischer, massenspektrometrischer Parameter des Ionentransfers und der TOF‐Detektion konnten die Signalintensitäten der Mykotoxine weiter gesteigert werden. Zusätzlich wurde, um eine sichere Identifizierung der Zielanalyten zu gewährleisten, ein Fragmentierungsexperiment in die Messmethode etabliert. Im data‐independent broad‐band collision induced d/ssoc/at/on‐(bbCID‐)Fragmentierungsmodus wurden sowohl die Nachweisgrenzen (limits of detection , LODs) als auch die Matrixeffekte der 36 Mykotoxine in Hausstaubmatrix bestimmt. Die niedrigsten LODs wurden dabei für Aflatoxin Bi (AFBi) sowie für die untersuchten Enniatine mit Werten zwischen 40,9 μg/kg (Enniatin Bi, ENBi) und 89,8 μg/kg (AFBi) erreicht. Die LODs weiterer Analyten wie Gliotoxin (GTX), HT 2 Toxin (HT 2), Satratoxin G (SAT G) und den Stachybotrychromenen wurden mit Werten von >1 mg/kg bestimmt, sodass insgesamt die Empfindlichkeit vorheriger Studien, in denen Mykotoxine in Hausstaub mittels TandemMassenspektrometrie (MS/MS) analysiert wurden, für einen Großteil der Verbindungen nicht erreicht werden konnte. Als grundlegende Ursache wurden weiterhin die immensen Einflüsse von Matrixbestandteilen auf den massenspektrometrischen Nachweis ausgemacht, die für 32 Mykotoxine eine Signalreduktion um mehr als Faktor 2 hervorriefen, wobei für zwölf Analyten sogar weniger als 30% der erwarteten Signalflächen zu beobachten waren. Zur Steigerung der Signalintensitäten und zur Verringerung der Matrixeinflüsse wurde im weiteren Verlauf des Projektes eine moderne Ionenquelle mit zusätzlicher Zufuhr von erhitztem Zerstäubungsgas sowie einem aktiven Absaugsystem (active exhaust) eingesetzt. Unter Verwendung der VIP‐HESI‐(uacuum insulated probe heated electrospray ionization‐)Ionenquelle wurden für 26 von 36 untersuchten Mykotoxinen die LODs in Hausstaub durchschnittlich um den Faktor 2,5 im Vergleich zur vorherigen Methode verringert. Eine zusätzliche Auftrennung der Ionen anhand ihrer Bewegung in der Gasphase durch den Einsatz eines Ionenmobilitätsspektrometers (IMS) verbesserte für fast alle Mykotoxine die Selektivität des Nachweises und erleichterte den Identifizierungsprozess in Hausstaubmatrix. Eine empfindlichere Detektion hingegen wurde nicht erreicht. Die entwickelten UHPLC‐HRMS‐Ansätze waren somit trotz verschiedenster Anpassungen nicht ausreichend sensitiv, um den Nachweis von Mykotoxinen in Hausstaub in niedrigsten Konzentrationsbereichen zu ermöglichen. Insgesamt kann auf Basis dieser Ergebnisse die Verwendung hochauflösender Massenspektrometer für die Spurenanalytik in komplexen, unaufgereinigten Matrices als eingeschränkt geeignet bewertet werden. Aufgrund der hohen Selektivität stellt die HRMS‐Analytik jedoch unabhängig von den genannten Limitierungen ein wichtiges Werkzeug für non‐target‐Anwendungen sowie für die interferenzarme Analyse dar. Die bestehende UHPLC‐QTOF‐HRMS‐Methode wurde daher im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit um 64 Analyten erweitert und ermöglicht zukünftig den Nachweis eines diversen Analytspektrums in den unterschiedlichsten Matrices. Um das Ziel der Charakterisierung des Vorkommens von Mykotoxinen in Schimmelpilz‐belasteten Innenräumen zu erreichen, wurde unter Verwendung eines modernen TandemMassenspektrometers eine sensitivere Nachweismethode entwickelt und validiert. Unter den bereits etablierten Bedingungen der Probenvorbereitung und der chromatographischen Trennung wurden mittels MS/MS‐Detektion die niedrigsten LODs für Enniatin B (ENB) (0,100 μg/kg) und weitere Depsipeptide wie ENBi (0,500 μg/kg) und Beauvericin (BEA) 1,40 μg/kg erzielt. Zudem konnten weitere Mykotoxine wie Sterigmatocystin (STG; 3,40 μg/kg), Aflatoxin B2 (AFB2) und Fumonisin Bi (FBi; beide 9,00 μg/kg) empfindlich detektiert werden. Im Vergleich zur UHPLC‐QTOF‐HRMS‐ Analytik nach VIP‐HESI‐Ionisierung entsprachen diese Werte einer Steigerung der Empfindlichkeit für 32 der 36 untersuchten Mykotoxine um bis zu Faktor 272. Neben einer höheren Gesamtsensitivität des MS/MS‐Nachweises ist diese Beobachtung vor allem darauf zurückzuführen, dass überwiegend geringe Effekte durch coeluierende Matrix‐komponenten auf das analytische Messsignal zu verzeichnen waren. Die Ergebnisse durchgeführter Validierungsexperimente bestätigten die Anwendbarkeit der entwickelten UHPLC‐MS/MS‐Methode für die quantitative Analytik, sodass der Ansatz zur Untersuchung von 2i Hausstaubproben angewandt wurde, in denen insgesamt acht verschiedene Mykotoxine nachgewiesen werden konnten. Insbesondere die Depsipeptide Enniatin A (ENA), ENB, ENBi und BEA, welche in 80% der Proben detektiert wurden, sowie der Aflatoxin‐Vorläufer STG stellten dominante Verbindungen innerhalb des Probensets dar. Mittels matrix‐matched‐Kalibrierungen wurden mit Gehalten von bis zu 3i45 μg/kg zudem teilweise besonders hohe STG‐Kontaminationen in einzelnen Hausstäuben quantitativ bestimmt. Zur Erstellung der verwendeten Kalibrierlösungen wurden Mykotoxin‐Referenzsubstanzen verwendet, deren Konzentrationen unter anderem mittels qNMR (quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy) eingestellt wurden. Die Entwicklung der zugrundeliegenden Methodik war ebenfalls Teil der experimentellen Arbeiten des vorgestellten Projektes und fand unter Einsatz der Absolutbestimmungsmethode mit Thymol als internem Standard statt. Um das Mykotoxinvorkommen in Innenräumen vollständiger abzubilden, wurde die UHPLC‐MS/MS‐ Methode zusätzlich zur Untersuchung von Mykotoxinen in weiteren Innenraummatrices herangezogen. Dazu wurde ein Probenset bestehend aus 5i Materialien wie Tapeten und expandiertem Polystyrol (EPS) mit natürlichem Schimmelpilzbefall analysiert. Im Rahmen morphologischer und mikroskopischer Differenzierungen der enthaltenen Schimmelpilze wurden 18 Spezies identifiziert, wobei die Gattung Penicillum (n=41) sowie der Aspergillus versicolor‐Komplex (n=36) dominant waren. In den Proben waren 16 Mykotoxine detektierbar, darunter STG, zehn verschiedene Phenylspirodrimane (PSDs), zwei Satratoxine, ein Stachybotry‐chromen und zwei Enniatine. Insbesondere STG zeigte erneut ein verbreitetes Vorkommen und war in 45% aller Materialien in stark variierenden Gehalten von 0,516‐979 ng/cm2 nachweisbar. Phenylspirodrimane lagen in acht Proben, entsprechend einem Anteil von 16%, vor und wiesen mit bis zu 7,7 μg/cm2 2α Acetoxystachybotrydialacetat (ACDIAL AC) die höchsten Gehalte auf. Innerhalb ergänzend durchgeführter HRMS‐Untersuchungen unter Verwendung des entwickelten Multi‐MykotoxinScreeningansatzes wurde mit 2α Acetoxystachybotry‐lactamacetat (ACLAC AC) zudem ein weiteres PSD identifiziert und hinsichtlich der Gattung Stachybotrys wurden insgesamt positive Zusammenhänge zwischen vorkommenden Toxinen und den mikrobiologischen Belastungsdaten festgestellt. Wie auch im Rahmen der Untersuchung von Hausstaubproben wurde während der Analytik von Materialproben eine akkurate Kalibrierung angestrebt. Aufgrund variabler Matrices, Vorbehandlungen und Belastungsgraden war es nicht möglich, auf Basis von matrix‐matched‐ Kalibrierungen zu quantifizieren. Um auftretende Matrixeffekte dennoch zu berücksichtigen, wurde die Echo‐Signal‐Technik eingesetzt. Das Abschätzen und die Kompensation auftretender Effekte erfolgte dabei anhand eines zweiten Analytsignals (Echo‐Signal) im Chromatogramm, dessen Erzeugung durch die Adaption des Trenn‐ und Injektionssystems sowie der Detektionsmethode ermöglicht wurde. Innerhalb des untersuchten Probensets wurden dabei in nur sieben von 51 Proben Matrixeffekte festgestellt, aufgrund derer die Echo‐Signale um mehr als 30% im Vergleich zu Messungen in reinem Lösungsmittel abwichen. Mit den entwickelten Methoden und generierten Daten leistet die vorliegende Arbeit einen wichtigen Beitrag zur Expositionsabschätzung von Mykotoxinen im Innenraum. Zum einen wurden qualitative und quantitative Methoden zur instrumentellen Analytik von Hausstaub und Innenraummaterialien entwickelt, die auch die Möglichkeit bieten, Untersuchungen in diversen weiteren Matrices wie Raumluft standardisiert durchzuführen. Zum anderen wurden repräsentative Probensets aus Schimmelpilz‐belasteten Wohnräumen analysiert und mit den PSDs, den Depsipeptiden und STG dominante Verbindungen identifiziert, denen potenziell auch eine gesundheitliche Relevanz zukommt. Auf Basis dieser Ergebnisse sowie unter Verwendung der entwickelten Methodiken stellt die Mykotoxinanalytik zukünftig eine sinnvolle Ergänzung routinemäßig durchgeführter Schimmelpilz‐Untersuchungen im Innenraum dar, um gesundheitliche Risiken zu minimieren. Da weitere Parameter wie die Aufnahme, Toxizität und Bioverfügbarkeit diverser Mykotoxine bisher nicht vollständig aufgeklärt sind, kann anhand der generierten Daten an dieser Stelle keine Abschätzung von Expositionen und Risiken vorgenommen werden. Auch in Zukunft wird eine weiterführende Charakterisierung der gesundheitlichen Auswirkungen von Mykotoxinen auf Bewohnende Schimmelpilz‐befallener Wohnungen nur gelingen, sofern die Mykotoxinforschung in diesem Rahmen ebenso konsequent verfolgt wird, wie es seit den 1960er‐Jahren für toxische Sekundärmetaboliten in der Nahrungskette vollzogen wird.