NMM肿瘤DNA疫苗乙二胺四乙酸二钠残留量高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立NMM肿瘤DNA疫苗原液中乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)残留量高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,并进行验证,用于DNA疫苗质量控制.方法 将NMM肿瘤DNA疫苗原液与硫酸铜络合后,建立EDTA-2Na残留量HPLC检测方法:色谱柱为Agilent ZORBAXSB-C18(150mm×4.6mm,5μm);流动相为水-10％四丁基氢氧化铵-乙腈溶液(74.5∶0.5∶25);检测波长为254 nm;流速为0.8 mL/min;柱温为20 ℃;进样量为20 μL.对方法的专属性、线性范围、检测限及定量限、溶液稳定性、耐用性、准确度、精密度进行验证.用建立的方法对多批次DNA疫苗原液中EDTA-2Na残留量进行检测.结果 EDTA-2Na对照品及加入EDTA-2Na的DNA疫苗原液与硫酸铜反应后,在5.3 min附近出现吸收峰,而DNA疫苗原液与硫酸铜反应后未见吸收峰;对照品在4～400μg/mL范围内,与峰面积呈良好的线性关系,R2=0.999 9;该方法检测限为10 ng/mL,定量限为40 ng/mL;对照品及供试品溶液放置12 h,溶液稳定性良好;方法检测条件发生微小变动时(不同流动相比例、不同流速、不同柱温),对检测结果的影响在可接受范围内;低、中、高浓度加标样品EDTA-2Na回收率均值为101.38％,RSD为0.39％;0.1mg/mL对照品溶液连续进样6次,峰面积RSD为0.04％,6份供试品溶液均未检出EDTA-2Na,含EDTA-2Na的供试品溶液峰面积RSD为0.02％,中间精密度良好.多批次DNA疫苗原液均未检测出EDTA-2Na残留.结论 建立的方法操作简便,准确可靠,专属性强,可用于DNA疫苗原液中EDTA-2Na残留量检测.