血液淤积红细胞裂解诱导椎板切除术后硬膜外瘢痕增生的机制研究

目的:探讨小鼠椎板切除术后切口血液淤积红细胞破裂释放白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）诱导硬膜外瘢痕组织增生的机制。方法:取6~8周龄野生型小鼠12只，制作T 12~L 2椎板切除模型，随机分为假手术组、生理盐水干预手术组、单纯红细胞干预手术组、全血干预手术组。术后第30天取切口区域标本行HE染色和Masson染色，观察是否出现血液淤积；并通过免疫印迹技术检测四组术后第30天的瘢痕组织中纤连蛋白水平，采用免疫组化染色方法观察术后硬膜外瘢痕增生程度。取野生型小鼠以及IL-33敲除小鼠红细胞，按生理盐水孵育或红细胞裂解液裂解处理方法分为野生型小鼠红细胞生理盐水对照组、IL-33敲除小鼠红细胞生理盐水对照组、野生型小鼠红细胞裂解组、IL-33敲除小鼠红细胞裂解组，通过免疫印迹技术检测四组红细胞中的IL-33水平。抽取小鼠血液后进行梯度离心提取较为纯净的红细胞，按红细胞小鼠来源类型及干预措施分为野生型小鼠红细胞空白对照组、野生型小鼠相对对照组（仅加二抗，检验是否有非特异性结合）、野生型小鼠红细胞组、IL-33敲除小鼠红细胞组（检验一抗是否有抗原特异性），行免疫荧光染色以及流式细胞仪检测IL-33水平。 结果:椎板切除术后HE染色和Masson染色示手术组小鼠切口区域局部有血液淤积，全血或红细胞干预小鼠术后切口区域的硬膜外瘢痕增生程度更高，尤其是全血干预组；野生型红细胞生理盐水对照组、IL-33敲除红细胞生理盐水对照组及IL-33敲除红细胞裂解组几乎检测不到IL-33的表达，而野生型红细胞裂解组可检测到明显的IL-33表达；免疫荧光染色示野生型小鼠红细胞膜内及膜上均有IL-33表达，而其他三组几乎检测不到IL-33或极少量的非特异性表达，四组IL-33免疫荧光强度分别为0.62±0.41，60.17±4.39，16.78±7.43和0.61±0.03（ F=281.90， P<0.001），其中野生型小鼠红细胞组IL33表达量最高（ P<0.05）；流式细胞仪检测结果，除野生型小鼠红细胞组检测出微量IL-33外，其他三组的IL-33表达基本为0。四组小鼠造模区域纤连蛋白与β-actin的比值呈现逐渐升高的趋势，分别为0.79±0.09、1.26±0.23、1.79±0.05和2.29±0.58，差异均有统计学意义（ F=12.86， P=0.002）。与假手术组相比三个手术组（生理盐水对照组、红细胞干预组及全血干预组）手术区域纤连蛋白明显升高；四组小鼠造模区域纤连蛋白免疫组化染色结果与免疫印迹实验相同，纤连蛋白光密度值分别为0.09±0.01、0.18±0.01、0.22±0.01和0.24±0.01，差异有统计学意义（ F=210.7， P<0.001）。 结论:小鼠椎板切除术后手术区域有血液淤积，且一定程度上可以导致硬膜外瘢痕组织增生程度加重；红细胞膜内膜外有大量的IL-33表达，促进硬膜外瘢痕组织增生的机制可能与红细胞裂解释放IL-33有关。