八角枫碱通过ERK信号通路抑制神经细胞生长和分化诱导神经毒性的研究

目的:研究八角枫中的主要活性成分八角枫碱对神经细胞增殖、分化及细胞外信号调节激酶(ERK)通路的影响,探讨其神经毒性及毒性机制.方法:采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y和人神经胶质瘤U251细胞作为体外评价模型,通过CCK-8和中性红摄取试验测定细胞毒性;Hoechst 33342核酸染色法检测染色质凝集情况;MitoTracker Red CMXRos线粒体红色荧光探针染色法检测线粒体膜电位的变化;分光光度法检测半胱氨酸蛋白酶Caspase-3、Caspase-9的活力;Western blot法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、波形蛋白(VIMENTIN)及BCL2相关X蛋白(BAX)、B淋巴细胞瘤-2(BCL2)、聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)、磷酸化的细胞外信号调节激酶(P-ERK)和细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白表达;采用维甲酸诱导神经元分化,检测分化的SH-SY5Y细胞神经突生长和退化的情况.结果:与空白对照组相比,50 μg/mL-2 000 μg/mL八角枫碱能明显抑制U251和SH-SY5Y的细胞生长(P＜0.05或P＜0.01),作用呈剂量和时间依赖性;八角枫碱作用于U251细胞24 h后,显著抑制胶质细胞标志物GFAP、VIMENTIN蛋白的表达;八角枫碱处理24 h后,U251细胞和SH-SY5Y细胞出现明显凋亡形态学改变,表现为细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光及线粒体膜电位降低,线粒体活性减弱;八角枫碱可剂量依赖性抑制分化的SH-SY5Y神经突的生长及诱导其神经突退化,表现为神经突数量减少,神经突的长度变短;与空白对照组相比,八角枫碱能剂量依赖性明显增加Caspase-3和Caspase-9的酶活力(P＜0.05或P＜0.01),上调BAX表达,下调BCL2表达,促进PARP切割,明显抑制ERK蛋白的磷酸化水平.结论:八角枫碱能抑制神经细胞及神经胶质细胞的增殖,并抑制神经元轴突的生长.其作用机制可能通过抑制ERK通路,上调BAX表达,下调BCL2表达,促进PARP切割,增加Caspase-3、Caspase-9活力,从而促进线粒体依赖性细胞凋亡.