circZKSCAN1抑制肝癌细胞侵袭转移的机制

目的:探讨circZKSCAN1抑制肝癌细胞侵袭转移的机制。方法:利用前期构建的差异表达circZKSCAN1基因的HepG2肝癌细胞进行实验。采用克隆形成实验、划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验分别检测OE组（过表达circZKSCAN1的HepG2）、SH-1和SH-2组（沉默circZKSCAN1的HepG2）、NC组（阴性对照的HepG2）肝癌细胞的迁移和侵袭能力。采用生物信息学方法分析circZKSCAN1上富集RNA结合蛋白（RBP）的结合位点，并通过RNA免疫共沉淀（RIP）和RNA pull-down实验验证其靶标RBP，分析靶标RBP与肝癌生存预后的关系。4组克隆形成数、迁移和穿膜细胞数比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。两组富集倍数比较采用t检验。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。结果:克隆形成实验显示，NC组、OE组、SH-1组、SH-2组克隆形成数分别为（10.5±1.1）、（4.7±0.8）、（21.7±1.8）、（22.6±2.6）个，与NC组相比，OE组克隆形成数明显减少，而SH-1组、SH-2组克隆形成数明显增多（LSD-t=-7.386，9.196，7.424；P<0.05）。划痕实验结果显示，与NC组相比，OE组24、48 h的迁移能力明显下降，而SH-1组、SH-2组24、48h的迁移能力则明显升高。Transwell细胞迁移实验表明，NC组、OE组、SH-1组、SH-2组迁移细胞数分别为（28.5±4.3）、（14.3±2.6）、（47.2±7.7）、（49.6±8.0）个，与NC组相比，OE组迁移细胞数明显减少，而SH-1组、SH-2组迁移细胞数明显增多（LSD-t=-4.895，3.673，3.474；P<0.05）。Transwell细胞侵袭实验显示，NC组、OE组、SH-1组、SH-2组穿膜细胞数分别为（21.3±2.1）、（7.6±1.5）、（38.6±5.8）、（41.3±7.1）个，与NC组相比，OE组穿膜细胞数明显减少，而SH-1组、SH-2组穿膜细胞数明显增多（LSD-t=-9.195，4.858，4.679；P<0.05） 。生物信息学分析显示，circZKSCAN1上富集RBP结合位点包括EIF4A3、FMR1、hnRNPC、U2AF65等。RIP实验显示circZKSCAN1可将细胞内的EIF4A3显著富集，与NC组相比，OE组富集倍数为（7.82±0.25）倍（t=1.057，P<0.05）。RNA pull-down实验显示EIF4A3可与circZKSCAN1结合。在线网站（http://gepia.cancer-pku.cn）分析显示，与癌旁组织相比，EIF4A3基因在肝癌组织中高表达，并主要出现在较晚分期的肝癌中（F=7.72，P<0.05），而高表达EIF4A3基因的肝癌患者具有更差的总体生存率（HR=1.90，P<0.05）。结论:EIF4A3是circZKSCAN1的靶标RBP，circZKSCAN1可能通过与EIF4A3结合抑制肝癌细胞的侵袭转移能力。