非洲猪瘟病毒A137R蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)A137R蛋白鼠源单克隆抗体(MAb),本研究通过原核系统表达并纯化了重组A137R(rA137R),将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到2株能够稳定分泌A137R MAb的杂交瘤细胞株3D1和2C3.亚类试剂盒鉴定结果显示,两株MAb重链亚类均为IgG1,轻链亚类均为Kappa链.采用间接ELISA方法测得MAb 3D1和2C3的腹水效价均高于105,选取效价较高的MAb 3D1用于后续试验.采用western blot检测制备的MAb 3D1与293T细胞中过表达的A137R(不同剂量)及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后(感染后不同时间)天然表达的A137R的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测Mab 3D1与293T细胞中过表达的A137R的反应性.Western blot结果显示,过表达A137R的293T细胞出现了 15 ku左右的特异性条带,且随着转染质粒量浓度的增加,蛋白表达量增加;感染ASFV的PAMs中(感染后8 h)出现了 15 ku左右的特异性条带,且随着感染时间的延长,蛋白表达量增加.IFA结果显示,在过表达A137R的293T细胞中出现绿色荧光.以上结果表明,制备的MAb 3D1既能够与过表达的A137R反应,也能够与天然表达的A137R反应,反应性较强.将MAb 3D1用于激光共聚焦试验中检测ASFV感染PAMs后不同时间A137R的细胞定位;用于免疫共沉淀(Co-IP)试验中检测293T细胞中过表达的A137R和Flag-Agarose结合的反应性.激光共聚焦试验结果显示,ASFV感染PAMs后6h出现绿色荧光,且荧光主要在细胞质中,随着感染时间的延长,绿色荧光逐渐增多增强,表明A137R主要定位于细胞质中.Co-IP试验结果显示,Mab 3D1可以检测到结合在Beads上的A137R,出现约15 ku的特异性条带,表明Mab 3D1可以用于Co-IP试验.利用一系列表达部分重叠的重组A137R片段并经western blot鉴定两株Mab识别的表位;根据western blot结果合成一系列多肽并包被ELISA板,采用间接ELISA方法进一步筛选Mab识别的抗原表位,并利用western blot验证筛选到的抗原表位.结果显示,A137R氨基酸序列中的18NFHRCAWEE26和64AWHEVPECREFI75分别为Mab 3D1和2C3的抗原表位.本研究首次制备了 ASFV A137R蛋白的Mab,并进行了初步应用研究,还对其进行了表位鉴定,为进一步将该MAb利用于ASFV的检测和疫苗研究提供了实验依据.