circ-13267通过let-7-19/ERBB4通路调控蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡

[背景]蛋鸭卵泡发育是决定其产蛋性能的关键因素.已有研究表明,禽类卵泡发育是极为复杂的生物学过程,目前人们已对家禽的卵泡发育模式有了一定的了解,但作为决定产蛋量的重要因素,卵泡发育的具体调控机理仍需进一步深入研究.颗粒细胞是卵泡中主要的功能细胞,可调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟,同时也精确的调控卵泡的生长发育,维持卵巢的正常功能(诱导排卵、维持成熟分裂的阻断、为卵母细胞提供底物等).circRNA是一类新型的内源性非编码RNA,在卵泡发育中发挥重要的调控作用.[目的]通过构建circRNA过表达载体上调circ-13267的表达,研究circ-13267在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的作用及其调控机制,为蛋鸭卵泡发育的调控机制解析提供依据.[方法]首先,利用Q-PCR检测蛋鸭卵泡颗粒细胞的细胞质与细胞核中circ-13267的表达水平;构建circ-13267的过表达载体circ-13267-pLCDH,在蛋鸭颗粒细胞中过表达 circ-13267后,利用 Q-PCR 法检测 circ-13267、let-7-19、ERBB4、FAS和BCL2的表达水平;分别转染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR于蛋鸭卵泡颗粒细胞,24 h后利用EdU法检测蛋鸭卵泡颗粒细胞的增殖能力;将circ-13267的线性序列或ERBB4的3'UTR克隆到pmirGLo载体中,同时对上述野生型序列中的let-7-19结合位点进行突变,得到表达突变型序列的载体,利用双荧光素酶报告基因验证circ-13267与let-7-19及let-7-19与靶基因ERBB4的结合关系;在蛋鸭卵泡颗粒细胞中转染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR,利用流式细胞术和Annexin V-FITC检测蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡情况.[结果]环状RNA circ-13267在细胞质和细胞核中均有表达;双荧光素酶报告基因试验结果显示,let-7-19能与ERBB4结合,进而下调荧光素酶的活性,当ERBB4序列中let-7-19的结合位点突变后,let-7-19则无法抑制荧光素酶的表达,说明ERBB4是let-7-19的一个靶基因;荧光定量检测结果显示,过表达环状RNAcirc-13267后BCL2基因的表达显著降低(P＜0.05),而FAS和ERBB4基因的表达量显著升高(P＜0.05),当过表达let-7-19后,ERBB4基因的表达量显著升高(P＜0.05),而抑制let-7-19后ERBB4基因的表达量显著降低(P＜0.05);EdU试验结果显示,过表达circ-13267后蛋鸭卵泡颗粒细胞数量显著减少,说明其促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡;然而,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中共转染circ-13267和let-7-19后,与对照组相比共转染组中BCL2和FAS的表达量均无显著变化(P＞0.05),而与过表达circ-13267组相比,共转组中BCL2基因的表达量极显著降低(P＜0.01)、FAS的表达量极显著升高(P＜0.01),说明circ-13267促进蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡的作用被抑制;利用流式细胞仪检测转染后的蛋鸭卵泡颗粒细胞发现,与共转染circ-13267和let-7-19组相比,仅过表达circ-13267后,晚期凋亡细胞数和总凋亡细胞数均显著增加(P＜0.05),而活细胞数显著降低(P＜0.05).[结论]蛋鸭circ-13267在蛋鸭卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中均有表达,circ-13267可以吸附let-7-19并靶向ERBB4基因,从而促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,为解析蛋鸭卵泡发育的调控机制提供理论依据.