小鼠Nr1d1基因生物信息学分析及其慢病毒干扰载体的构建

[目的]研究旨在分析小鼠Nr1d1基因序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建并筛选出干扰效率最优的小鼠Nr1d1基因慢病毒干扰载体.[方法]对小鼠Nr1d1核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析;设计合成4对小鼠Nr1d1基因的特异性shRNA序列和1对无义序列;分别将它们连接至pCD513B-U6慢病毒干扰载体上构建重组质粒,通过PCR及测序鉴定,分别将鉴定正确的重组质粒命名为pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-1(sh1)、pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-2(sh2)、pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-3(sh3)、pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-4(sh4)和pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-NC(shn);将重组质粒和辅助包装质粒共转染至HEK293T细胞中,收毒后将病毒颗粒感染小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞);使用荧光显微镜观察HEK293T细胞和NIH3T3细胞中的绿色荧光蛋白表达情况;Western Blotting检测并筛选出干扰效率最佳的载体.[结果]小鼠Nr1d1基因编码区序列全长1848 bp,编码615个氨基酸,其中丝氨酸含量最高(14.0％),色氨酸含量最低(0.5％);小鼠Nr1d1基因核苷酸序列与大鼠、人及黑猩猩的相似性分别为94.8％、90.0％和90.0％;NR1D1蛋白可能与ARNTL、NCOR1和NPAS2等蛋白发生相互作用.成功构建4个小鼠Nr1d1基因的慢病毒干扰载体,将它们转染至HEK293T细胞后观察到绿色荧光蛋白表达;将病毒颗粒感染NIH3T3细胞后观察到绿色荧光蛋白表达;与对照组shn相比,慢病毒干扰载体sh2、sh3、sh4均能有效下调NR1D1蛋白的表达,且sh3的干扰效率最高.[结论]研究成功构建了小鼠Nr1d1基因的慢病毒干扰载体,筛选验证了其在NIH3T3细胞中的干扰效率,并对小鼠Nr1d1基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析,为进一步研究小鼠Nr1d1基因的生物学功能提供了前期理论基础和关键材料支撑.