不同植物源的黄烷酮-3-羟化酶的催化特性

[背景]黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)是黄酮类化合物代谢途径中的关键酶之一,不同植物来源的F3H催化特性可能存在差异,并对黄酮类化合物的生物合成产生重要影响.[目的]比较分析不同植物源F3H的酶学性质、异源催化能力差异,为今后在黄酮类化合物代谢工程中F3H的选用提供参考.[方法]通过系统进化分析选择来自茶树(Camellia sinensis)、银杏(Ginkgo biloba)和大豆(Glycine max)的F3H基因,诱导表达后用亲和层析对F3H进行纯化,以柚皮素为底物表征不同植物来源F3H的酶学性质;采用单因素分析法对F3H在原核宿主Escherichia coli和真核宿主Saccharomyces cerevisiae体内的催化活性进行分析.[结果]酶学性质分析发现,CsF3H、GbF3H和GmF3H的最适反应温度分别为40、40和35℃,最适反应pH值分别为7.5、7.0和7.5.催化动力学研究发现,CsF3H的kcat/Km为0.36 L/(mmol·s),高于GbF3H和GmF3H.体内催化实验表明,当底物柚皮素的浓度为500 μmol/L时,CsF3H、GmF3H单基因大肠杆菌工程菌对柚皮素的转化率达80％以上,而GbF3H工程菌对柚皮素的转化率仅为23.8％;3种单基因酵母工程菌对柚皮素的转化率都在40％左右,没有明显差异.[结论]不同植物源的F3H催化活性存在差异,而且同一种F3H在原核底盘细胞与真核底盘细胞中催化能力也存在较大差异,3种F3H中CsF3H具有优良的催化性能,并在原核底盘细胞内有较好的应用潜力.