黄姑鱼肠道上皮细胞体外分离培养及鉴定

本研究旨在建立黄姑鱼(Nibea albiflora)肠道上皮细胞的体外分离培养及鉴定方法,为海水鱼类肠道功能及其发病机制相关研究提供细胞模型.以黄姑鱼肠道组织为研究对象,采用胰蛋白酶(0.25％)、胶原蛋白酶(1 mg/mL)和透明质酸酶(0.16 mg/mL)联合消化法对肠道组织进行不同时间(0、20、40、60和80 min)的消化,并对消化后的肠道细胞及残留肠道组织分别进行台盼蓝和苏木精-伊红(HE)染色,再通过显微镜观察确定终止细胞消化的最佳时间.在此基础上,对肠道上皮细胞进行原代培养并传代.在传代培养过程中,通过分析细胞形态、细胞生长曲线和肠道上皮细胞标志性蛋白表达等对培养细胞进行鉴定.结果表明:黄姑鱼肠道组织在消化40 min时便可以得到较多的肠道上皮细胞,在消化60 min时可以得到更多的细胞团,至80 min时肠道上皮细胞基本从基膜上全部消化下来,因此,本研究建议在40～60 min终止细胞消化为宜.所培养的传代肠道细胞呈"铺路石"形态,生长曲线呈明显的"S"形,经角蛋白-18(CK?18)免疫荧光染色呈阳性.进一步的实时荧光定量PCR分析表明上皮细胞标志性蛋白封闭蛋白(Claudin)、闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO?1)、碱性磷酸酶(AKP)和上皮型钙黏蛋白(E?cadherin)在培养的传代细胞中均有表达.综合上述结果表明,本研究所分离培养的细胞即为黄姑鱼肠道上皮细胞.综上所述,本研究成功建立了黄姑鱼肠道上皮细胞的体外分离培养及鉴定方法,为海水鱼类肠道功能及其相关机制研究提供了技术支撑.