产酸克氏杆菌( Klebsiella oxytoca )钼铁蛋白α-423 Ile 位点的突变导致固氮酶催化活性降低

基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论，探索从与P原子簇共价相连的β-93 Cys 出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点. 通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构，利用体外定点突变和基因替代技术，将产酸克氏杆菌（ Klebsiella oxytoca ）固氮酶β-102 Asn ，α-431 Lys 和α-423 Ile 位点分别替换为β-102 Ala ，α-431 His 和α-423 Pro ，获得Nβ102A，Kα431H和Iα423P突变株. 3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响，其中Iα423P突变株几乎无固氮生长，细胞乙炔还原活性显著下降；在42 L发酵罐中培养，其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6；qRT-PCR检测发现此突变株 nifD 基因4倍的上调表达. 分离纯化Iα423P钼铁蛋白，其最高C 2 H 2 和H + 还原水平分别为野生型的13%和21%. 根据以上研究结果推论，突变固氮酶的催化活性显著降低，或与直接打破α-423 Ile 与高柠檬酸长臂之间的氢键有关，推测α-423 Ile 是固氮酶催化底物还原过程中，电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸.