Construction d’une muqueuse sous-épithéliale bronchique innervée à partir de cellules souches pluripotentes induites iPSC

Introduction Le projet vise a obtenir un modele organoide 3D d’epithelium bronchique immunocompetent innerve pour une application a l’asthme severe. L’asthme severe touche environ 5 a 15 % des patients asthmatiques. C’est un asthme non controle qui se caracterise par des exacerbations frequentes et graves, et pour lequel les traitements sont souvent inefficaces. La construction d’un epithelium bronchique immunocompetent et innerve devrait permettre la recherche de nouveaux medicaments. En effet, il sera possible de reprogrammer des cellules circulantes de patients atteints d’asthme severe en iPSCs et d’obtenir un modele personnalise, permettant de cribler et de l’etudier pharmacologiquement. Methodes Le projet comprend en parallele : – la construction d’une matrice extracellulaire sous-epitheliale dans laquelle des fibroblastes bronchiques sont ensemences ; – la differenciation d’iPSC reprogrammees a partir de PBMC circulants en progeniteurs neuronaux et cellules de Schwann. Les essais de matrice comprennent un melange collagene bovin de type I (10 mg/ml) et chitosan (2,8 mg/ml), fabriquee selon un protocole etabli a l’UPR 3572 (Muller et al., 2018) d’une part et une bioimpression de collagene et acide hyaluronique methacryles par nos collaborateurs de la plateforme Bioprint a Bordeaux (H Oliveira) d’autre part. La differenciation des iPSC en progeniteurs neuronaux est obtenue par inhibition de la voie des SMAD [SB431542 (40 mM) et LDN193189 (0,2 mM)] pendant 7 jours, puis de la GSK3β (CHIR99021, 3 μM). Les cellules sont cultivees dans des plaques 6 puits revetues de Geltrex™ et le milieu de culture est change chaque jour. Une partie des progeniteurs est differenciee en neurones sensitifs immatures par inhibition de la voie Notch (DAPT 10 mM). Ces neurones immatures seront ensemences sous la matrice ou la maturation sera induite par ajout de facteurs de croissance des nerfs : NGF (10 ng/mL), BDNF (20 ng/mL) et GDNF (10 ng/mL). L’autre partie des progeniteurs neuronaux est differenciee en cellules de Schwann jusqu’a maturation par ajout de neuroreguline 1 (192 ng/ml) pendant 21 jours ; elles seront ensemencees dans la matrice car leur presence favorise la croissance des neurones sensitifs (Blais et al., 2009). Le phenotype des lignees de neurones sensitifs et de cellules de Schwann est valide par immunomarquage 2D en fluorescence : anti-Tubuline s3 (1/400e) un marqueur neuronal, anti-substance P (1/2000e) et anti-neurofilament M (1/2000e) 2 marqueurs specifiques des neurones sensitifs, anti-Sox 10 (1/100e), marqueur des cellules de Schwann, anti-S100b (1/500e) (cellules de Schwann matures myelinisees ou non), anti-MBP (1/2000e) (cellules de Schwann matures myelinisees) et anti- P75NTR (1/2000e) (precurseurs et cellules de Schwann matures non myelinisees). Resultats Les resultats d’ensemencement des fibroblastes bronchiques humains dans les matrices montrent une colonisation des matrices collagene-chitosan, contrairement aux matrices bioimprimees. Cependant certaines matrices se sont dechirees apres quelques jours de culture, du a leur structure interne ; des mises au point sont en cours. Les neurones sensitifs sont positifs au neurofilament M, a la tubuline s3 et a la substance P : les iPSCs ont donc bien ete differencies dans la lignee neuronale. Les cellules de Schwann sont caracterisees au 10e jour de differenciation, ils sont positifs pour Sox 10, P75-NTR et S100b, mais ne presentent pas la MBP. Nous sommes donc en presence de cellules de Schwann matures non myelinisees. Ces cellules differenciees ont ete congelees et seront ensemencees dans les matrices une fois les mises au point terminees. Conclusion Les resultats obtenus sont prometteurs. A la fin des mises au point, la matrice selectionnee sera rendue immunocompetente par ensemencement de cellules dendritiques derivees de monocytes isoles. Des iPSCs seront deposees sur la matrice obtenue et differenciees en epithelium bronchique selon la methode de l’equipe de Montpellier (Ahmed, Fieldes et al., soumis) afin d’obtenir notre modele final.