美国白蛾碱性磷酸酶HcALP3基因的克隆、表达及功能分析

美国白蛾(Hyphantria cunea)是一种重要的世界性检疫害虫,也是我国重大入侵害虫之一.苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)作为目前研究应用最广泛的杀虫微生物之一,对美国白蛾的作用机制尚不清楚.为了明确美国白蛾中肠受体碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)与Bt Cry毒素的结合特性,探索Bt Cry毒素对其作用机理,本研究利用PCR方法扩增获得美国白蛾中肠碱性磷酸酶HcALP3基因(GenBankNo.MH796759),该基因的开放阅读框1 557bp,编码518个氨基酸.构建原核重组表达载体pET30a-HcALP3,转化大肠杆菌(Escherichiia coli)BL21,经 IPTG诱导表达56.65 kD 的 HcALP3蛋白.qRT-PCR方法进行组织和龄期表达分析,结果显示HcALP3在美国白蛾的各龄期均有表达,5龄幼虫表达量最高,在不同组织中,中肠的表达量最高;Ligand blot分析结果发现HcALP3重组蛋白仅可以与Bt Cry 1Ab35活化毒素特异结合,不与Bt Cry1Ac和Cry9Ea10结合.利用RNAi技术沉默HcALP3基因,HcALP3表达水平下降了 75.32％;注射dsRNA-HcALP3后的美国白蛾幼虫对Bt Cry1Ab35、Cry1 Ac和Cry9Ea10的校正死亡率分别为45.93％、73.33％和70％,对Bt Cry1Ab35的敏感性显著低于注射dsRNA-egfp的美国白蛾幼虫,推测HcALP3蛋白为Bt Cry1Ab35毒素的潜在功能受体.本研究通过对美国白蛾碱性磷酸酶HcALP3的鉴定及功能验证,为深入探讨Bt制剂防治美国白蛾的机制提供了科学依据.