基于斑马鱼模型和网络药理学的甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性生作用与机制研究

目的 利用斑马鱼模型结合网络药理学,研究甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性及作用机制,探讨附子-甘草配伍减毒的现代科学内涵.方法 选用受精后48 h(48 hpf)的健康野生型AB系斑马鱼,脱膜后随机移入6孔板中,每孔30枚.对照组加入新鲜养鱼水;模型组和各药物处理组均给予乌头碱溶液,终浓度均为10 μmol/L;各药物组同时分别给予低、中、高浓度(10、50、100 μmol/L)的甘草酸、甘草素、甘草苷和低、中、高浓度(1、5、10μ.mo l/L)的异甘草素,各组斑马鱼处理后放入恒温光照培养箱中培养至72 hpf,在显微镜下记录斑马鱼20 s心跳并拍照,计算心率,并利用Image-Pro Plus 5.0软件计算心包面积,筛选甘草中拮抗乌头碱心脏毒性的成分.通过心脏结构与功能分析、活性氧(ROS)和凋亡细胞检测,进一步验证甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用.基于PharmMapper、Swiss Target Prediction、STITCH数据库收集乌头碱毒性作用靶点,利用CTD、GeneCards、DisGeNET数据库,以"心脏毒性""心脏损伤""心衰"为关键词检索靶点,将上述两组靶点导入Draw venn在线绘图取交集,得到乌头碱心脏毒性作用靶点集;从PharmMapper数据库中收集甘草酸活性靶点集;将2个靶点集共有靶点导入String数据库进行蛋白互作分析;使用Cytoscape 3.6.0软件对结果进行拓扑分析,以节点度值中位数为标准筛选重要靶点;得到的靶点导入DAVID数据库,进行GO和KEGG分析.结果 与对照组比较,模型组幼鱼心包水肿显著(P＜0.01),心率显著升高(P＜0.01);与模型组比较,甘草酸与异甘草素各浓度组、甘草苷高浓度组心包面积显著下降(P＜0.01),甘草酸效果更加明显且呈浓度相关性;甘草酸低和高浓度、甘草素高浓度和异甘草素低浓度拮抗乌头碱所致心率加快效果显著(P＜0.05、0.01).甘草酸可浓度相关性地拮抗乌头碱导致的斑马鱼心室短轴缩短率降低,且高浓度组具有显著性差异(P＜0.01);甘草酸显著抑制乌头碱诱导的斑马鱼体内活性氧生成(P＜0.01);明显减弱乌头碱导致的细胞凋亡.甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性的作用机制可能与MAPK、 GRB2、CDC42、EGFR、GSK3B、SRC等关键靶点,以及PI3K-Akt、Ras、FoxO等信号通路相关.结论 甘草酸可以显著拮抗乌头喊心脏毒性,可能通过调控PI3K-Akt、 Ras信号通路等发挥作用.