外周伤害性感受神经元在体特异性表达GCaMP6f蛋白方法的构建及细胞内钙活动的监测

目的:建立在外周伤害性感受器特异性表达GCaMP6f蛋白的方法,并在疼痛刺激条件下,应用钙成像技术实时监测小鼠伤害性感受神经元的细胞内钙活动.方法:包装并纯化rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒,并通过立体定位注射该病毒于SNS-Cre小鼠L4/L5背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)内.动物存活3～4周,然后制备L4/L5整节DRG标本,检测GCaMP6f蛋白表达情况,并观察疼痛刺激条件下诱致的伤害性DRG神经元的钙反应情况.结果:SNS-Cre小鼠L4/L5 DRG内注射rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒后,荧光显微镜观察显示GCamp6f病毒特异性地表达在中、小型的DRG神经元.给予DRG神经元高钾刺激(KCl 30 mmol/L)可以诱致神经元胞内的钙离子水平显著上升.进一步给予伤害性DRG神经元特异性标志物TRPV1受体的激动剂Capsaicin(1 μmol/L),结果显示其可以诱致GCamp6f蛋白标记的DRG神经元呈现显著的钙反应.结论:本研究建立的SNS-Cre小鼠DRG在体注射rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒特异性标记伤害性DRG神经元的方法是成功的,该方法的成功建立对于活体特异性监测伤害性DRG神经元的功能活动提供了重要工具.