干扰素γ和TRAIL联合对HaCaT细胞程序性坏死的影响及机制研究

目的 观察干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合对HaCaT人角质形成细胞程序性坏死的诱导作用,并探讨其作用机制.方法 HaCaT细胞分为阴性对照组(不加药物处理)和实验组,实验组分别加入50 μg/L IFN-γ(IFN-γ组)、4μg/L TRAIL(TRAIL组)、50 μg/L IFN-γ+4μg/L TRAIL(细胞因子联合组),或40 μmo/L zVAD预处理1h后同时加入50 μg/LIFN-γ及4μg/L TRAIL(zVAD联合组).作用48 h后,光镜下观察细胞形态,噻唑蓝法检测药物对细胞的增殖抑制作用,双染色法流式细胞仪检测细胞坏死情况,qPCR检测RIP3、MLKLmRNA相对表达量,Western印迹检测细胞RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化蛋白等的表达,免疫荧光染色观察pRIP3、pMLKL在细胞中的表达分布,以2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯为荧光探针检测各处理对细胞内活性氧产生的影响.采用SPSS 22进行统计学分析,不同组间观察指标的变化采用单因素方差分析,两两多重比较采用LSD-t检验.结果 细胞因子联合组及zVAD联合组作用48 h后HaCaT细胞出现坏死样形态特征.噻唑蓝实验显示作用48 h后,IFN-γ组、TRAIL组、细胞因子联合组、zVAD联合组、阴性对照组细胞存活率分别为73.16％±5.71％、81.46％±4.68％、72.18％±2.93％、69.67％±3.24％、100％,5组间差异有统计学意义(F=24.34,P＜0.001).细胞因子联合组、zVAD联合组细胞坏死率分别为9.86％±1.31％、10.33％±2.16％,均高于阴性对照组(5.26％±0.91％,t值分别为4.61、5.07,均P＜0.05).qPCR结果示,细胞因子联合组、zVAD联合组RIP3、MLKLmRNA表达水平明显高于阴性对照组(tRIP3分别为0.99、1.84,tMLKL分别为1.51、2.17,均P＜0.05).Western印迹结果示,与阴性对照组相比,细胞因子联合组RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化蛋白表达水平升高(均P＜0.05),且zVAD预处理后caspase 8水平下降,上述蛋白表达进一步升高.荧光显微镜示IFN-γ和TRAIL联合作用后,细胞质中可见强绿色点状或团块状荧光斑点(pRIP3),在细胞膜可见明显红色荧光斑点(pMLKL).活性氧检测示细胞因子联合组平均荧光强度高于阴性对照组,t=702.00,P＜0.05.结论 IFN-γ和TRAIL可联合诱导HaCaT细胞程序性坏死,并伴有活性氧水平上升.