氧化型辅酶NAD+及布氏杆菌SahH活性位点对SahH催化活性的影响

[目的]本文旨在鉴定影响布氏杆菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SahH)催化S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)产生同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)的催化活性位点.[方法]将表达载体pET28a-Bru-sahH转化大肠杆菌BL21中,表达、纯化布氏杆菌SahH(Bru-SahH)蛋白,分析辅酶NAD+、磷酸化修饰及活性位点对Bru-SahH催化活性的影响.[结果]添加NAD+后,Bru-SahH的催化活性降低85.6％;对Bru-SahH质谱分析表明,其444位丝氨酸为可能的磷酸化位点,对该位点突变后Bru-SahH催化SAH形成HCY的活性降低85.5％;生物信息学分析表明,Bru-SahH的337位和338位氨基酸为其活性位点,分别对上述2个位点进行单突变和双突变,突变后的Bru-SahH催化活性降低90.8％以上.[结论]Bru-SahH的337、338和444位氨基酸是其催化活性位点,添加外源性NAD+可抑制其催化活性.