菠菜乙醇酸氧化酶的酶学特性及同工酶电泳分析

为了解析菠菜乙醇酸氧化酶(SpGLO)的酶学特性及同工酶谱.首先提取菠菜的RNA并反转录成cDNA,通过NCBI数据库中提供的菠菜GLO基因mRNA序列信息,设计特异性引物,扩增目标序列并连接到pMD19-T载体上进行测序鉴定;随后再次设计引物并在上游引物加入His标签,克隆SpGLO基因构建到pYES2载体上,将该载体转入酿酒酵母中进行表达并通过His-tag亲和柱纯化,然后在不同诱导时间点取样测定SpGLO酶活.结果显示,转化后的酿酒酵母菌株在诱导发酵20 h后能得到最高的GLO活性.以乙醇酸为底物测定SpGLO在不同pH、不同温度条件下的催化活性,其最适pH值为8.0,最适温度为39℃.然后分别以乙醇酸、乙醛酸、甘油酸为反应底物,系统分析了SpGLO的酶学特性,数据显示,SpGLO对乙醇酸的亲和力最高,其Km为0.41 mmol/L,Vm为45.92μmol/(min·mg).以乙醇酸、乙醛酸为底物,使用草酸抑制其催化活性,其Ki分别为4.61,2.09 mmol/L,表明以乙醛酸为底物时SpGLO的催化活性更易被草酸抑制.同时将纯化后的SpGLO通过Caps-氨水电泳体系进行同工酶电泳,经过染色后出现2条同工酶带,表明菠菜叶片中可能存在2种GLO同工酶.为将来深入研究植物GLO同工酶之间的生化特性差异并分析其不同生理功能奠定良好的基础.