新生隐球菌毒力差异菌株的全基因组测序及毒力相关基因的筛选

目的：了解及分析新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neoformans var grubii)两组毒力差异明显的多位点微卫星型(multilocus microsatellite typing,MLMT)菌株的全基因组序列,筛选出引起其毒力差异的相关基因。方法选取毒力差异最为明显的不同基因型菌株各1株进行全基因组重测序,运用比较基因组学方法全面分析测序结果,使用非同义 SNPs(non-synonymous SNPs,nsSNPs)、无义突变 SNPs、产生移码突变 InDels 的策略广泛筛选差异基因。对筛选出的基因在所有实验菌株中进行 DNA 测序验证,并提取总 RNA,采用快速扩增5′和3′cDNA 末端(rapid amplification of 5′ and 3′cDNA ends,RACE)技术,克隆后测序获得对应基因的完整 cDNA 全长序列信息。结果通过全基因组重测序,环境株 IFM56731和临床株 IFM56800均分别获得127倍和111倍覆盖率的有效数据。分别对 SNPs 和 InDels 数据进行统计分析,应用无义突变 SNPs 和产生移码突变的 InDel 分别筛选出3个差异基因。对筛选出的6个基因在所有实验菌株中进行扩增测序,并对其中3个基因进行 cDNA的测序分析,最终确定基因 CNAG_01032的转录序列位置和结构,并验证了预测的无义突变位点存在于实际的 mRNA 中。结论本研究通过全基因重测序数据分析证明,应用无义突变 SNPs 和产生移码突变的 InDels 进行差异基因筛选的策略具有较好针对性,并筛选出6个潜在与毒力相关的基因,通过对所有实验菌株的测序和对全长 cDNA 的测序验证,最终筛选出基因 CNAG_01032为可能引起菌株毒力差异的基因。