芹黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增生的影响

背景 青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增生是滤过手术失败的丰要原因,寻找抑制术后HTFs增生的药物可提高滤过手术的成功率. 目的 观察芹黄素对HTFs体外生长的抑制效应并探讨其作用机制.方法 斜视手术中获取的人眼Tenon囊组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养,免疫荧光法进行细胞波形蛋白检测以鉴定培养的HTFs.取第3～5代HTFs接种于96孔板中,加入0、20、40、80、160 μmol/L芹黄素后继续培养,于24、48、72 h后分别取一块96孔板,在酶联免疫检测仪上检测560 nm波长处各组细胞的吸光度(A560)值,磺基罗丹明B(SRB)法测定细胞的增生能力.分别在培养基中加入40、80、160 μmol/L芹黄素,同时在不同浓度芹黄素组培养基中均加入10 μg/L BrdU,继续培养48 h,在各组同一个视野下分别拍摄荧光显微镜和光学显微镜照片,计算BrdU的标记率,以未添加任何芹黄素(0μmol/L)组为对照组.用Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察培养细胞的形态学改变,采用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况和细胞周期的变化. 结果 培养的细胞生长状态良好,免疫荧光法检测可见细胞对波形蛋白呈阳性反应,为细胞质中均匀的绿色荧光,确定培养的细胞为HTFs.SRB法检测结果显示,HTFs的增生值(A560)随着芹黄素浓度的增加而逐渐下降,同浓度芹黄素组HTFs A560值随着作用时间的延长逐渐下降,差异均有统计学意义(F组别=480.306,P=0.000;F时间 =555.144,P=0.000).0、40、80 μmol/L芹黄素作用HTFs 48 h后BrdU的标记率分别为(87.860±0.632)％、(61.520±4.306)％、(23.480±4.472)％,各组之间的总体比较差异有统计学意义(F=299.347,P=0.000),其中40 μmol/L、80 μ mol/L芹黄素组HTFs BrdU的标记率均明显低于0 μmol/L芹黄素组,差异均有统计学意义(P＜0.05).Hoechse 33258染色发现,不同浓度芹黄素组的细胞数目减少,随着芹黄素浓度的增加,细胞核固缩和变形的细胞数目增加.流式细胞术检测发现,随着芹黄素浓度的增加,G0/G1期细胞的百分数逐渐增加,而S期和G2/M期细胞的百分数逐渐下降,差异均有统计学意义(FG0/G1 =58.621,P=0.000;Fs=32.357,P=0.001；Fc2/M =83.998,P=0.000).0、40、80、160 μmol/L芹黄素作用72 h后,细胞的凋亡率分别为(4.77±0.21)％、(13.24-±1.35)％、(18.33±1.86)％、(31.58±2.77)％,4个组的总体差异有统计学意义(F=204.791,P＜0.05). 结论 芹黄素通过诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G0/G1期而抑制HTFs的增生,其作用呈剂量和时间依赖性.