黄芩素对缺氧诱导的视网膜神经胶质细胞中脯氨酸羟化酶2表达的抑制作用

背景 脯氨酸羟化酶2(PHD2)是缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)降解酶,能够调控缺氧诱导的新生血管形成过程中血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)等多种促血管生成因子的表达.黄芩素对PHD2有抑制作用,了解其对缺氧诱导的视网膜神经胶质细胞中PHD2表达的抑制作用有助于了解相关新生血管性眼病的机制及其防治. 目的 观察PHD2在缺氧诱导的视网膜神经胶质细胞中的表达变化,探讨黄芩素对PHD2过表达的抑制作用及其意义. 方法 将出生48 h以内SPF级SD乳鼠用体积分数10％水合氯醛麻醉后以颈椎脱臼法处死,分离双侧视网膜后采用组织块培养法分离培养鼠视网膜神经胶质细胞,采用兔抗羊胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对神经胶质细胞进行鉴定.将培养的细胞分为正常对照组、CoCl2组和CoCl2+黄芩素组,其中正常对照组细胞进行常规培养,CoCl2组细胞培养液中添加200 μmol/L CoCl2以制备缺氧细胞模型,CoCl2+黄芩素组细胞培养液中添加200 μmol/L CoCl2和50 μmol/L黄芩素溶液.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞增生情况;采用免疫荧光染色法检测各组鼠视网膜神经胶质细胞中PHD2和VEGF的表达及其定位;采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中PHD2和VEGF mRNA的相对表达量;采用Western blot法定量检测各组细胞中PHD2和VEGF蛋白的表达量. 结果 各组鼠视网膜神经胶质细胞增生值(吸光度,A值)总体比较差异有统计学意义(F=132.05,P=O.00),其中CoCl2组鼠视网膜神经胶质细胞增生值明显高于正常对照组和CoCl2+黄芩素组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).免疫荧光检测显示,正常对照组细胞中PHD2和VEGF均呈弱表达,CoCl2组细胞中PHD2和VEGF均呈强阳性表达,CoCl2+黄芩素组细胞中PHD2和VEGF表达较CoCl2组减弱.正常对照组、CoCl2组和CoCl2+黄芩素组细胞中PHD2 mRNA相对表达量分别为0.366±0.034、0.894±0.015和0.445 ±0.017,PHD2蛋白相对表达量分别为131.27±2.61、140.12±4.29和133.14±2.11,VEGF mRNA相对表达量分别为1.346±0.008、3.465±0.048和2.264±0.073,VEGF蛋白相对表达量分别为532.25±19.92、601.13±10.21和537.34±5.96,组间总体比较差异均有统计学意义(PHD2:F=905.89、43.18,均P＜0.01;VEGF:F=27.13、185.79,均P＜0.01),其中CoCl2组PHD2和VEGF mRNA及蛋白相对表达量均明显高于正常对照组和CoCl2+黄芩素组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 体外低氧环境促进鼠视网膜神经胶质细胞增生,同时诱导视网膜神经胶质细胞中PHD2和VEGF的表达上调.黄芩素可有效抑制低氧环境下PHD2过表达引起的神经胶质细胞的增生和相关促血管生成因子的表达,PHD2有望成为缺氧性视网膜血管新生疾病的防治靶点.