Estudo in vitro de infecção pelo vírus da hepatite B

Introducao: A organizacao mundial da saude estima que 257 milhoes de pessoas apresentam a infeccao cronica pelo virus da hepatite B (VHB) no mundo, sendo que maioria das mortes atribuida a esta infeccao sao decorrentes das complicacoes devido a cirrose hepatica e ao adenocarcinomahepatocelular. A inexistencia de um sistema de replicacao e manutencao, in vitro, do VHB dificulta o desenvolvimento de novos agentes anti-virais. Dessa forma, o modelo proposto neste estudo pode fornecer condicoes para o melhor entendimento do ciclo de replicacao viral, em sistema in vitro, e proporcionar novas estrategias para o desenvolvimento de agentes anti-VHB. Objetivo: Desenvolver uma plataforma in vitro de infeccao pelo VHB, sustentavel, de forma simplificada, de baixo custo de manutencao, que possibilite avaliar a estabilidade da infeccao em cultura celular e condicoes de armazenamento. Metodologia: As celulas Huh-7.5 foram cultivadas em meio de cultura DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 1% solucao de aminoacidos nao essenciais, penicilina 10.000 UI mL-1, estreptomicina 10 mg mL-1 e foram mantidas em estufa a 5% de CO2 e 37 °C. As celulas, apos crescimento, com confluencia superior a 80% em garrafa de cultura de 25cm2, foram tratadas com tripsina 0,25% e EDTA e sua concentracao ajustada para os ensaios de infeccao. O isolado viral foi obtido a partir de um pool de soro positivo para o VHB, com carga viral de 2,04×108copias.mL-1, e para a infeccao, acrescentou-se o pool de soro VHB positivo em meio de cultura completo.Para a quantificacao da carga viral, 500 µL do sobrenadante da cultura celular foram utilizados para extracao do DNA-VHB e amplificacao por qPCR. Foi realizado tambem ensaio de quimioluminescencia para determinar a presenca do antigeno de superficie HBsAg. Resultados e discussao:A extracao do DNA viral por particulas magneticas e amplificacao por qPCR dos sobrenadantes resultou em uma media de 19.000 copias.mL-1 no sobrenadante da cultura celular, com a infeccao se mantendo detectavel por 50 dias em garrafa de cultura. A reacao de quimioluminescencia qualitativa revelou um resultado positivo para o antigeno de superficie HBsAg, confirmando a infeccao viral. Conclusao: A plataforma proposta produziu uma quantidade significativa de particulas virais, permanecendo ativa por quase dois meses, e o antigeno de superficie do virus foi detectado, comprovando a presenca do virus. O regime de infeccao in vitro com celulas Huh-7.5 podera ser muito promissor para conduzir as investigacoes sobre os mecanismos moleculares relacionados a infeccao viral, alteracoes de metabolismos e/ou expressao genica relacionadas com sua patologia e pesquisa de novos farmacos para o controle da infeccao/doenca.