BB. Investigação do teor de amônio de cultivos submersos de Streptomyces clavuligerus utilizando dois diferentes métodos analíticos

Introducao: Streptomyces clavuligerus produz varios compostos beta-lactâmicos, como o antibiotico cefamicina C (CefC) e o inibidor de beta-lactamases acido clavulânico (AC), e nao beta-lactâmicos, como holomicina e tunicamicina. Muitos precursores destes bioativos sao compostos nitrogenados, o que torna o metabolismo do nitrogenio um aspecto chave no estudo da dinâmica entre os metabolismos primario e secundario neste microrganismo. Varios estudos tem evidenciado tanto a influencia positiva de fontes especificas de nitrogenio na producao de bioativos por S. clavuligerus como a influencia negativa do acumulo de ions amonio na biossintese de compostos beta-lactâmicos. Assim, uma analise quantitativa destes ions nos caldos de cultivo permitem tracar formas de controle da concentracao de amonio nestes meios. Diversos metodos de analise de nitrogenio amoniacal estao descritos na literatura, com enfase para a quantificacao no meio ambiente (aguas, ar, residuos industriais). Os principais fatores na escolha de um metodo que viabilize uma quantificacao confiavel sao a concentracao do ion e a presenca de interferentes, sendo este ultimo um problema importante a ser contornado em se tratando de matrizes complexas como os caldos de cultivo de microrganismos. Objetivo: Adequacao de metodo de quantificacao de amonio em cultivo submerso de S. clavuligerus. Metodologia: Amostras foram coletadas a cada 3 horas durante o cultivo em biorreator em meio contendo como fontes de nitrogenio (em mmol/L) lisina (50) e glutamato de sodio (50), pH=7,2. A biomassa foi separada do caldo resultante dos cultivos por centrifugacao e determinada como massa seca de celulas. O sobrenadante foi submetido a analises de concentracao dos bioativos CefC e AC. Para determinar NH 4+ , foram realizadas e comparadas duas analises: (1) o classico metodo espectrofotometrico-colorimetrico do fenato consistindo de reacao entre NH 3 com fenato e hipoclorito que, na presenca de um catalisador (nitroprussiato de sodio, por ex.), forma um composto azul (indofenol); (2) utilizando um analisador Ion Seletivo (ISE) – neste caso, a presenca de ions interferentes do caldo foi contornada reagindo-se previamente a amostra com solucao NaOH 5M, sendo o NH 3 formado arrastado com fluxo de N 2 para outro recipiente contendo solucao de HCl 0,1M, recuperando-se os ions NH 4+ (formacao de NH 4 Cl). Resultados e discussao: A maxima biomassa foi obtida em 30 horas de cultivo (ca. 8,5 g/L) e as maiores concentracoes de bioativos em torno de 60 horas (380 mg/L de CefC e 130 mg/L de AC). O acumulo de amonio foi crescente ate o final do cultivo (881 ppm e 917 ppm, pelos metodos de fenato e ISE). Conclusao: A maior concentracao de CefC obtida comparativamente a de AC mostrou que este ultimo e mais afetado pelo acumulo de NH 4+ . Em relacao aos metodos utilizados para analise de amonio, ambos foram adequados, apresentando resultados da mesma ordem de grandeza.