一种谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除载体的构建及应用

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）23604编码赖氨酸胞内转运蛋白基因lys P为敲除对象,利用重叠PCR技术将lys P基因的上下游同源臂融合,并构建了由木糖启动子P;和毒素蛋白基因maz F组成的筛选盒,同时无缝克隆连接至带有卡那霉素抗性基因的p TOPO载体中,经电转化及两次同源单交换筛选,实现lys P基因的无痕敲除。结果表明,经过卡那霉素抗性筛选、木糖二次筛选及基因组PCR鉴定后,成功获得lys P基因缺失菌株C.glutamicum 23604Δlys P;发酵后C.glutamicum 23604Δlys P赖氨酸产量较对照菌株产量提高了10.8%。该实验以大肠杆菌毒素蛋白基因maz F作为反向筛选标记的敲除载体,实现谷氨酸棒杆菌lys P的高效敲除;lys P基因的敲除使得赖氨酸不能进入胞内而在胞外积累,从而达到增产赖氨酸的目的。