离体大鼠主动脉内皮细胞氧化应激损伤模型的建立及评价

目的:建立离体大鼠主动脉内皮细胞氧化应激损伤模型,为细胞损伤及细胞凋亡的调控研究提供基础.方法:大鼠断头处死在无菌条件下开胸取主动脉,经组织块培养法后传代培养得到充足主动脉内皮细胞,接种于96孔板或爬片培养,每组设6个复孔,用于之后的各项试验检测.以不加H2O2的组作为对照组,以不同浓度的H2O2(l00、200、300、400、500 μmol/L)作用于内皮细胞相同时间12h,来筛选最佳作用浓度;依据结果以相同浓度的H2O2(100和200 μmol/L)分别作用不同时间(3、6、9、12及24 h),来筛选最佳作用时间.通过免疫荧光法鉴定、细胞存活率检测、生化指标(LDH-L、NO、MDA、SOD)检测及内皮细胞凋亡指数等变化,评价及验证模型的建立.结果:对细胞内Ⅷ型胶原抗原进行免疫荧光染色后鉴定血管内皮细胞培养成功;在12 h的相同作用时间下,随着H2O2浓度的加大,细胞存活率呈显著下降(77.63％±5.20％ ～ 40.90％±2.10％);相同浓度(100 μmol/L组和200 μmol/L组)随着作用时间的增加,细胞存活率呈显著递减(100 μmol/L组为86.83％±12.11％ ～44.26％±5.70％,200 μmol/L组为78.28％±11.98％～34.45％±5.87％);以H2O2浓度为100 μmol/L作用3、6、9、12及24h,培养液中生化指标在9h后LDH-L与MDA呈显著递增,NO与SOD呈显著递减;在H2O2浓度为100 μmol/L与作用时间12 h的条件下,流式检测结果显示内皮细胞凋亡率为16.92％±2.37％,显著高于对照组2.68％±0.47％ (P＜ 0.01);TUNEL检测内皮细胞凋亡指数为17.65％±2.36％,显著高于对照组的3.23％ ±0.57％(P＜ 0.01).结论:该方法成功建立了体外血管内皮细胞氧化应激损伤模型,探索了轻重适度的诱导细胞损伤和细胞凋亡的造模方法,可以成为开展多种血管内皮细胞损伤及凋亡调控机制研究的基础.