携带肝细胞生长因子基因慢病毒转染人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶支架构建可注射型组织工程脂肪的实验研究

目的 探讨构建可注射型组织工程脂肪的可行性,为临床软组织缺损修复及美容填充提供简便易行的方法.方法 取脂肪抽吸术获取的脂肪组织,采用酶消化法分离培养获得人脂肪来源干细胞(humanadipose-derived stem cells,hADSCs),进行细胞形态观察、流式细胞术及成脂诱导鉴定.用携带肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒HGF-GFP-LVs,以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)(分别为10、30、50、100)转染hADSCs,计算转染效率以确定最适MOI.取SPF级6周龄单纯T细胞缺陷BALB/c雌性裸鼠10只,将经过最适MOI HGF-GFP-LVs转染并成脂诱导的hADSCs与纤维蛋白胶混合注入裸鼠背部右侧皮下(转染组),单纯成脂诱导的hADSCs与纤维蛋白胶混合注入背部左侧皮下(未转染组),单纯纤维蛋白胶注入颈后正中皮下(空白对照组),每点注射0.4 mL.移植后12周处死裸鼠,取出移植物,行大体观察、湿重测量、HE染色、GFP荧光标记检测及免疫荧光染色观察,评价种子细胞的体内成脂能力以及移植物血管新生情况.结果 经鉴定所培养细胞为hADSCs.MOI为10和30时HGF-GFP-LVs转染率较低,MOI为50和100时转染率较高(均＞80％),确定最适MOI为50.移植12周,转染组和未转染组均获得外观类似脂肪组织的新生物,湿重分别为(32.30±4.06) mg和(25.27±3.94) mg,差异有统计学意义(t=3.929,P=0.001);空白对照组未见新生物.转染组新生脂肪细胞数为(126.93±5.36)个/视野,显著高于未转染组的(71.36±4.52)个/视野(t=30.700,P=0.000).荧光显微镜下可见部分单房脂肪细胞发出网状绿色荧光.免疫荧光染色示转染组血管密度为(16.37±2.76)个/视野,显著高于未转染组的(9.13±1.68)个/视野(t=8.678,P=0.000).结论 以hADSCs为种子细胞,经慢病毒转染HGF基因并成脂诱导后与纤维蛋白胶支架复合可在体内成功构建成熟脂肪,能促进移植后的血管新生,从而提高移植物的存活率.