IK6过表达慢病毒载体的构建及其在THP1细胞系中的表达和生物学特征

本研究旨在构建人IK6基因过表达的慢病毒载体,观察其在THP1细胞株中的表达及对其生物学特征的影响,为研究该基因在白血病中的作用提供基础.采用RT-PCR方法获得目的基因,并与线性化慢病毒载体pGC-FU重组构建慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP,通过菌落PCR鉴定、测序比对分析,确定克隆的正确性.使用Lipofectamine 2000,将慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP转染293T细胞,测定病毒滴度后转染THP1细胞株,用流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测靶细胞内IK6 mRNA表达,Western blot检测IK6-GFP融合蛋白,进一步观察THP1生物学特征的改变.结果表明,利用RT-PCR方法获得IK6目的基因并连接到线性化的慢病毒载体上,成功构建具有Amp抗性的pGC-FU-IK6-GFP质粒并转染293T细胞,获得滴度为2.0×109TU/ml的病毒.用目的质粒转染THP1细胞,转染效率可达90％.在靶细胞中检测到IK6 mRNA表达和IK6-GFP融合蛋白表达.IK6能够促进靶细胞克隆形成并且具有抑制凋亡的作用,而对细胞周期无显著影响.结论:成功构建IK6过表达的慢病毒载体,使IK6在THP1细胞株中稳定表达.对靶细胞生物学研究发现IK6极为可能干扰了正常Ikaros蛋白的抑癌作用,并存在潜在的抗凋亡作用,进而在一定程度上促进白血病细胞生长,但对细胞周期无明显影响.该研究为进一步探讨IK6在急性髓系白血病的作用奠定了基础.