刚地弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)真核表达载体的构建、表达及其激酶活性分析

目的 构建刚地弓形虫RH株棒状体蛋白17 (ROP17)真核表达载体,对表达产物进行激酶活性的检测和功能分析. 方法 根据刚地弓形虫ROP17蛋白编码基因(GenBank登录号为AM075203.1)设计引物,以弓形虫RH株速殖子总RNA为模板,RT-PCR扩增目的基因片段,克隆至真核表达载体p3×Flag-CMV-14,构建重组质粒p3 ×Flag-CMV-14/ TgR OP17.经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染至人胚肾细胞(HEK293T),RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析表达产物；Western blotting检测其激酶活性；流式细胞术分析ROP17对转染宿主细胞凋亡的影响. 结果 RT-PCR结果显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1 850 bp的基因片段.菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒p3 ×Flag-CMV-14/TgROP 17构建成功且序列正确.RT-PCR和Western blotting结果显示,在转染p3 ×Flag-CMV-14/TgROP17的细胞中有TgROP 17的表达,基因片段大小为1 850bp,蛋白质相对分子质量(Mr)约为70 000,而转染空质粒组未见表达.Westem blotting结果显示,ROP17可以磷酸化c-Jun蛋白；流式细胞术结果显示,ROP17抑制喜树碱(CPT)诱导的细胞凋亡,6h和12 h的抑制率分别为20.6％和24.1％,两者差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 成功构建了真核表达载体p3 ×Flag-CMV-14/TgROP17,其表达产物具有激酶活性且能够抑制细胞凋亡.