4-羟基壬烯酸诱导酒精性肝病的分子机制

目的 通过体内动物实验和体外细胞实验,探讨4-羟基壬烯酸(4-HNE)对肿瘤坏死因子(TNF)介导的肝细胞内核因子κB (NF-κ B)抗凋亡通路的抑制作用及其机制,进一步从细胞信号通路及蛋白质翻译后修饰水平揭示4-HNE促TNF介导酒精性肝病(ALD)的发病机制.方法 用Lieber-DeCarli小鼠模型、人肝癌细胞株HepG2和小鼠原代肝细胞,通过四甲基偶氮唑盐法、乳酸脱氢酶测定、Westem blot、免疫荧光染色等检测4-HNE对TNF介导的肝细胞损伤作用及4-HNE表达水平；通过酶联免疫吸附实验、实时荧光定量PCR检测肝细胞内NF-κ B的含量、其与DNA的结合活性及其所调控的抗凋亡基因的表达情况；用Western blot及免疫共沉淀技术检测NF-κB抑制蛋白(IκBα)及其激酶(IKK)的磷酸化以及4-HNE对IκBα、IKK的翻译后修饰水平.计量资料两个样本均数间比较用t检验,多个样本均数间比较用方差分析. 结果 (1)体内动物实验:模型组小鼠肝内甘油三酯水平(36.1±6.9) mg/g、血浆ALT水平(39.8±8.9) U/L和肝内TNF水平(650.8±28.9) pg/g明显高于对照组[分别为(13.6±3.2) mg/g、(18.3±4.1) U/L和TNF (320.2±14.1)pg/pg,差异有统计学意义,JP值均＜0.01.与对照组相比,模型组小鼠4-HNE与蛋白质形成的加合物增多,肝细胞脂质变性、细胞凋亡增多,肝细胞核内NF-κ B(p65)与DNA的结合活性(0.13±0.01)也较对照组(0.17±0.03)明显下降(t=4.178,P＜0.05),NF-κB(p65)蛋白表达水平降低,IκBα蛋白磷酸化水平降低,4-HNE-I κ B α加合物增多.(2)体外细胞实验:①在HepG2及小鼠原代肝细胞中,与TNF组相比,4-HNE/TNF组肝细胞增殖活性下降,随着4-HNE、TNF浓度的增加,增殖活性呈剂量依赖性降低,细胞凋亡增多,细胞释放的乳酸脱氢酶活性升高(F=7.262,P＜0.05),4-HNE/TNF组明显诱导聚腺苷二磷酸核糖聚合酶蛋白剪切.②在HepG2细胞和小鼠原代肝细胞中,随着4-HNE浓度升高,细胞内4-HNE与蛋白质形成的加合物增多,与TNF组相比,4-HNE/TNF组肝细胞内4-HNE与IκBα形成的蛋白质加合物增多,I κB α的蛋白磷酸化水平降低.③随着4-HNE浓度升高,HepG2细胞核内NF-κB (p65)与DNA的结合活性下降,NF-κB调控基因(cFLIP、cIAP、Bcl-2)的mRNA表达水平下降.④4-HNE对TNF诱导的IKK无明显作用.结论 长期摄入乙醇导致的肝损伤与体内4-HNE和TNF水平均有关.4-HNE可以通过与肝细胞内IκBα形成蛋白质加合物降低IκBα的磷酸化水平,抑制肝细胞内TNF介导的NF-κB抗凋亡信号通路,从而显著增加肝细胞对TNF杀伤作用的敏感性,诱导肝细胞死亡.