靶向preC/C基因特异性RNA干扰对乙型肝炎病毒在肝癌细胞系中复制与表达的影响

目的 探讨靶向乙型肝炎病毒(HBV) preC,/C基因的小干扰RNA(siRNA)在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2.2.15细胞中抗病毒基因治疗效果.方法 根据GenBank中HBV(GenBank登录号U95551)基因组序列,设计合成靶向HBV preC/C基因的3个长21核苷酸(nt)的siRNA,设计1个对照的非同源长21nt的siRNA,分别克隆到pU6质粒中,构建3个shRNA表达载体pU6-C1,pU6-C2,pU6-C3和对照pU6-C4;为了检测siRNA功能建立报告基因系统,以pT-HBV1.3为模板,PCR合成目的基因preC/C,克隆到绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pEGFP-N1)中构建携带EGFP报告基因的重组质粒pEGFP-preC/C( E-C).将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞,或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2.2.15细胞.首先,在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数,评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应；接着在HepG2.2.15细胞中,运用ELISA检测转染后24、48、72和96 h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量；免疫荧光技术检测转染后72 h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平；实时荧光定量PCR( real-time PCR)进一步检测HBV mRNA转录产物cDNA的拷贝变化.结果 发现siRNA表达质粒与E-C共转染Huh-7细胞后48 h,与pEGFP-N1单质粒转染相比,pU6-C1,pU6-C2或pU6-C3共转染组使EGFP表达水平降低了80％,而对照pU6 -C4或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达,差异有统计学意义(P＜0.01)；免疫荧光技术检测发现HepG2.2.15细胞内HBsAg和HBcAg表达显著降低,real-time PCR发现pU6-C1、pU6-C2或pU6-C3共转染HepG2.2.15细胞后48 h,使mRNA转录产物的cDNA含量分别降低了73.9％±1.2％ (P =0.029)、48.2％±1.8％和35.8％±1.4％(P=0.037,0.040),而不论pU6-C4或pU6对照共转染组均不能降低cDNA含量,差异均有统计学意义(均P＜0.01)；pU6-C1结果与显微镜观察/流式细胞仪细胞计数、ELISA和免疫荧光技术检测结果相吻合.抗病毒效果48 h后作用明显,72 h达到高峰.结论 靶向preC/C基因的RNAi能够有效特异抗HBV在人类肝癌细胞系中的复制与表达.RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV/HIV有效的基因治疗技术.