Mesure de la sensibilité aux antibiotiques selon les conditions standards directement à partir de liquides biologiques infectés et d'hémocultures positives

Méthodes Pour les liquides biologiques infectés ( n = 23), une correspondance a été établie entre le dénombrement bactérien observé par champ sur le culot de centrifugation obtenu par cytospin et la dilution du liquide à utiliser pour obtenir un inoculum bactérien équivalent à celui utilisé dans les conditions standard de l'antibiogramme par diffusion et de la méthode du E-test. Pour les hémocultures détectées positives par l'automate BactALERT (26 entérobactéries, 29 staphylocoques et 11 pneumocoques), la dilution du bouillon d'hémoculture à effectuer pour obtenir ce type d'inoculum a été déterminée pour chaque type bactérien. Résultats Pour les liquides infectés, la dilution requise pour l'antibiogramme des entérobactéries et des staphylocoques est respectivement de 10 –1 et 10 0 pour 50 à 100 bactéries/champ, 10 –2 et 10 –1 pour 100 à 500, 10 –3 et 10 –2 pour 500 à 1000, et 10 –4 et 10 –3 pour plus de 1000. Un minimum de 50 à 100 bactéries/champ est requis pour déterminer les CMI des β-lactamines vis-à-vis d'une souche de pneumocoque infectant du liquide céphalorachidien. Pour les hémocultures, une dilution de 10 –4 pour les entérobactéries et de 10 –2 pour les staphylocoques et les pneumocoques permet de reproduire les conditions standard de l'antibiogramme, et une dilution de 10 –1 , celles du E-test pour les β-lactamines vis-à-vis du pneumocoque. Conclusion Selon la procédure décrite, les tests de sensibilité aux antibiotiques sont disponibles 24 heures plus tôt. Abstract Objective Determining the conditions, which would allow us to apply bacterial antibiotic susceptibility tests directly to infected biological fluids and positive blood cultures and in accordance with the standard conditions of these tests. Methods For infected fluids ( N = 23), a correlation was determined between the bacterial count observed by microscopic field on a cystopin centrifugation pellet and the dilution required to obtain bacterial inocula corresponding to those used in the standard antibiogram and E-test methods. For blood cultures detected positive with the BactALERT system (26 Enterobacteriaceae , 29 Staphylococcus and 11 Pneumococcus ), the broth dilution required to obtain such inocula was determined for each bacterial type. Results For infected fluids, the dilution required for the antibiogram of enterobacterial and staphylococcal isolates was respectively of 10 −1 and 10 0 when there were 50 to 100 bacteria/field, 10 −2 and 10 −1 for 100 to 500, 10 −3 and 10 −2 for 500 to 1000, and 10 −4 and 10 −3 for > 1000. A minimum of 50 to 100 bacteria/field was required to determine β-lactam MICs towards a pneumococcal isolate present in cerebrospinal fluid. For blood cultures, a broth dilution of 10 −4 for Enterobacteriaceae and of 10 −2 for Staphylococcus and Pneumococcus allowed to reproduce the standard antibiogram. To reproduce the standard conditions of the E-test method for β-lactam MICs towards a pneumococcal isolate, the broth dilution was 10 −1 . Conclusion Following the procedure described, antibiotic susceptibility can be available 24 h earlier. Mots clés Sensibilité aux antibiotiques Antibiogramme par diffusion E-test Tests directs Liquides biologiques infectés Hémocultures positives Keywords Antibiotic susceptibility tests The agare diffusion method The E-test method Direct testing Infected biological fluids Positive blood cultures 1 Introduction L'isolement d'une souche bactérienne à partir d'un prélèvement biologique et l'évaluation de sa sensibilité aux antibiotiques requièrent en général 48 heures. Face à ce délai, il est habituel que le traitement antibiotique soit institué juste après le prélèvement et choisi en tenant compte : ● du type de pathologie infectieuse ; ● des espèces bactériennes les plus fréquemment en cause dans cette pathologie ; ● des taux de résistance vis-à-vis des antibiotiques habituellement utilisés ou recommandés pour cette pathologie. En un mot, le traitement est empiriquement déterminé. Face aux taux de résistance de plus en plus élevés et touchant le plus souvent plusieurs familles d'antibiotiques pour une même souche, la tendance est d'instituer, particulièrement en milieu hospitalier, des traitements empiriques qui font appel à des molécules dont l'usage devrait être réservé au traitement d'infections dues à des bactéries démontrées résistantes aux molécules classiquement recommandées. Réduire le délai entre le moment du prélèvement et le rendu du résultat de la sensibilité aux antibiotiques est donc une réelle préoccupation médicale, voire de santé publique, si on veut améliorer le bon usage des antibiotiques. Au regard de la standardisation [1] de tout test de sensibilité aux antibiotiques, qu'il soit manuel ou automatisé, il est indispensable d'isoler (minimum 18 heures d'incubation) la souche bactérienne pour préparer l'inoculum bactérien. En effet, une taille précise de l'inoculum est requise pour que la mesure effectuée (diamètre de la zone d'inhibition, CMI, croissance ou non croissance de la souche à des concentrations d'antibiotique déterminées) soit comparable d'un laboratoire à l'autre et interprétable en termes de catégorisation clinique de la souche (Sensible, Intermédiaire ou Résistante). En conséquence, l'obtention d'un gain de temps a jusqu'ici principalement porté sur le raccourcissement du temps d'incubation requis pour la mesure de la sensibilité de la souche isolée. Ce raccourcissement a notamment pu être obtenu avec l'arrivée de l'automatisation des tests de sensibilité aux antibiotiques [2–5] . Il faut néanmoins noter que, d'une part, ces automates ne sont pas encore disponibles dans tous les laboratoires et que, d'autre part, le gain de temps est plus souvent théorique que pratique dans la mesure où il n'y a pas toujours un prescripteur à disposition quand le résultat du test de sensibilité est « livré » en dehors des heures des visites dans les services, à l'exception des services de réanimation. Un autre moyen de gagner du temps dans le rendu du test de la sensibilité aux antibiotiques serait de pouvoir faire directement un antibiogramme à partir des prélèvements révélés positifs à l'examen direct. C'est cette hypothèse qui a été retenue dans le présent travail dont l'objectif a été de déterminer les conditions qui permettraient de faire un antibiogramme standard (méthode de diffusion en gélose) et de mesurer les CMI par la méthode du E-test directement à partir de liquides biologiques infectés et d'hémocultures positives. 2 Matériels et méthodes Des liquides biologiques [urine ( n = 20), liquide céphalorachidien de dérivation ventriculaire externe (DVE, n = 2), ascite ( n = 1)] infectés avec de fortes concentrations bactériennes (bacilles à Gram négatif de type entérobactérie ou cocci à Gram positif de type staphylocoque) ont été étudiés. Des flacons d'hémocultures détectés positifs par le système BactALERT 3D (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) avec des bacilles à Gram négatif type entérobactérie (15 flacons aérobies et 11 flacons anaérobies) ou des cocci à Gram positif type staphylococcique (19 flacons aérobies et dix flacons anaérobies) ont également été inclus dans l'étude. Par ailleurs, un isolat clinique de Streptococcus pneumoniae , vis-à-vis duquel les CMIs aux β-lactamines étaient connues (pénicilline G : 0,5 mg/l, amoxicilline : 0,38 mg/l et céfotaxime : 0,38 mg/l) a été utilisé pour inoculer un liquide de DVE stérile et des flacons d'hémocultures. 2.1 Liquides biologiques infectés Cinq cent microlitres du liquide non dilué et successivement dilué dans du sérum physiologique au demi et au dixième jusqu'à 0,5 10 −5 , ont été soumis à une centrifugation utilisant une cytospin (Cytotek, Bayer Diagnostics, Puteaux, France). Cette procédure de centrifugation a été retenue car elle offre une répartition des bactéries sur la lame plus homogène que le frottis fait à partir du culot obtenu après une simple centrifugation. Après coloration de Gram du culot « spoté » sur la lame de centrifugation, le nombre de bactéries par champ (objectif 100 à immersion) a été déterminé. Un antibiogramme selon la méthode de diffusion en gélose Mueller Hinton (Bio-Rad, Marne la Coquette, France) a été effectué, par flottage (10 ml de suspension bactérienne) et par écouvillonnage (300 μl de suspension bactérienne pour une gélose Mueller-Hinton carrée et 130 μl pour une gélose ronde) à partir du liquide biologique non dilué et de chaque dilution en utilisant un inoculum de taille décroissant de 10 en 10. Les dilutions de l'inoculum ont été faites en bouillon Mueller-Hinton (Bio-Rad, Marne-la-Coquette, France). Compte tenu du fait que d'une part, 10 ml de suspension bactérienne sont requis pour l'ensemencement par flottage et que d'autre part, il est rare d'avoir en microbiologie clinique 10 ml d'un liquide infecté, seules les dilutions de 10 −1 à 10 −6 ont été utilisées pour cette méthode d'ensemencement ( Tableau 1 ). En revanche, pour l'ensemencement par écouvillonnage, le liquide biologique à l'état pur et toutes ses dilutions (10 −1 à 10 −6 ) ont été testés puisqu'au maximum 500 μl sont requis pour faire l'antibiogramme par cette méthode d'ensemencement ( Tableau 2 ). La richesse de l'inoculum de chaque antibiogramme a été comparée, après une incubation de 18 heures à 37 °C, à celle de l'inoculum de l'antibiogramme fait selon les conditions standard [1] à partir de la souche isolée du liquide biologique en question. Ne disposant pas de liquide céphalorachidien infecté puisque ce prélèvement est généralement obtenu en très petite quantité, une expérience employant du liquide de DVE stérile et un isolat de pneumocoque a été faite. Ainsi, des colonies de pneumocoque ont été inoculées dans 1 ml de liquide de DVE afin d'obtenir, après centrifugation de 500 μl par cytospin et coloration de Gram du culot de centrifugation « spoté », entre 500 et 1000 bactéries/champ (objectif 100 à immersion). Les 500 μl de la suspension mère restant ont servi à fabriquer des suspensions bactériennes diluées de 10 en 10 dans du sérum physiologique jusqu'à 10 −3 . Le décompte bactérien/champ a été évalué pour chacune des dilutions comme précédemment décrit. Comme il est déterminant pour le traitement d'une infection à pneumocoque, notamment d'une méningite, de connaître les CMIs des β-lactamines, les CMIs de la pénicilline G, de l'amoxicilline et du céfotaxime ont été mesurées sur gélose Mueller-Hinton au sang (bioMérieux, Marcy-l'Étoile, France) par la méthode du E-test (AES, Combourg, France) d'une part, directement à partir du liquide DVE artificiellement infecté non dilué et dilué et d'autre part, à partir de ces mêmes liquides dilués au demi dans du bouillon Mueller-Hinton. Les valeurs des CMI de chaque antibiotique ainsi obtenues après 18 heures d'incubation à 37 °C ont été comparées à celles préalablement déterminées dans les conditions standard de la méthode du E-test (inoculum préparé à partir de colonies et correspondant à 0,5 McFarland). 2.2 Hémocultures Comme dans le système BactALERT 3D, les flacons d'hémocultures sont incubés sous agitation, les hématies mises en suspension empêchent de faire après coloration de Gram un dénombrement correct des bactéries quelle que soit la méthode de préparation du frottis (culot « spoté » après centrifugation par cytospin, frottis étalé avec une lamelle). Aussi, l'approche utilisée pour définir l'inoculum requis pour un antibiogramme correct directement à partir d'hémocultures positives, s'est appuyée sur la détermination de la concentration bactérienne en fonction de la courbe de réflectance. Dans la très grande majorité des cas, l'automate détecte la positivité de l'hémoculture quand la réflectance est entre 3000 et 4000 unités, ce qui correspond à la moitié ou à la fin de la phase exponentielle de la courbe de réflectance. Nous avons mis en évidence que les concentrations bactériennes sont à ce moment là très supérieures à 10 6 UFC/ml, quelle que soit l'espèce bactérienne. Si l'hémoculture persiste dans l'automate, la courbe de réflectance décrit assez rapidement une phase stationnaire. Nous avons mis en évidence qu'à cette phase la concentration bactérienne n'est pas tellement supérieure à celle observée au moment de la détection automatique de la positivité de l'hémoculture à mi- ou en fin de phase exponentielle. Au regard de ces résultats, les bouillons d'hémocultures positifs avec des bacilles à Gram négatif de type entérobactérie et des cocci de type staphylocoque ont été dilués en bouillon Mueller-Hinton de 10 en 10 jusqu'à 10 −5 . Un antibiogramme a été effectué par la méthode de diffusion en gélose Mueller-Hinton avec les dilutions 10 −1 , 10 −2 , 10 −3 , 10 −4 et 10 −5 . Les hémocultures positives à pneumocoque étant plus rares que les hémocultures positives à bacilles à Gram négatif et staphylocoques, des expériences ont été faites in vitro. Ainsi, différents flacons d'hémocultures ont été inoculés avec 4 ml de sang de cheval défibriné (OXOID, Dardilly, France) et 1 ml de suspension de pneumocoque à différentes concentrations. Tous ces flacons d'hémocultures ont été incubés dans le système BactALERT 3D. Les hémocultures détectées positives l'ont été alors que la courbe de réflectance était à mi- ou en fin de phase exponentielle. Comme pour les bacilles à Gram négatif et les cocci de type staphylocoque, la concentration de pneumocoque était au moment de la détection de la positivité et pendant la phase stationnaire très largement supérieure à 10 6  UFC/ml. Aussi, les bouillons d'hémocultures ont été dilués en bouillon Mueller-Hinton de 10 en 10 jusqu'à 10 −4 et un antibiogramme par diffusion en gélose Mueller-Hinton au sang ainsi que la mesure de la CMI de la pénicilline G, de l'amoxicilline et du céfotaxime par la méthode du E-test ont été effectués à partir de chaque dilution. La richesse de l'inoculum de chaque antibiogramme a été comparée, après une incubation de 18 heures à 37 °C, à celle de l'inoculum de l'antibiogramme fait selon les conditions standard [1] à partir de la souche isolée de l'hémoculture. Pour la méthode du E-test, les valeurs des CMI de chaque antibiotique obtenues après 18 heures d'incubation à 37 °C ont été comparées à celles préalablement déterminées dans les conditions standard de la méthode du E-test. 3 Résultats 3.1 Liquides biologiques infectés Comme l'indique le Tableau 1 prenant pour exemple l'urine infectée par des bacilles à Gram négatif de type entérobactérie, un antibiogramme, employant le flottage comme méthode d'ensemencement, peut être obtenu directement à partir du prélèvement avec une taille d'inoculum correspondant à celle de l'antibiogramme standard dès que l'examen microscopique du culot de centrifugation obtenu par cytospin montre ente 50 et 100 bactéries/champ. De façons répétitive et reproductible, quel que soit le type de liquide infecté (urine, ascite, DVE) par des bacilles à Gram négatif de type entérobactérie, nous avons observé le même type de correspondance entre le dénombrement bactérien et la dilution à effectuer à partir du liquide biologique infecté pour obtenir une taille d'inoculum correspondant à celle de l'antibiogramme standard ( Tableau 2 ). Concernant les cocci de type staphylocoque, pour un même dénombrement bactérien, la dilution à effectuer est dix fois moindre que celle effectuée pour les bacilles à Gram négatif de type entérobactéries ( Tableau 2 ). Dans le cas où l'ensemencement est fait par écouvillonnage, et parce qu'il faut moins de liquide biologique infecté pour effectuer ce type d'ensemencement (< 500 μl), nous avons mis en évidence qu'il est possible de faire un antibiogramme correct directement à partir du liquides dès que 25 à 50 bacilles à Gram négatif sont visibles par champ microscopique ( Tableau 2 ). Pour les cocci de type staphylocoque, cela n'est possible qu'en présence de 50 à 100 bactéries/champ. Concernant la mesure de la CMI de la pénicilline G, l'amoxicilline et le céfotaxime vis-à-vis de la souche de pneumocoque inoculée dans du liquide de DVE, il faut un minimum de 50 à 100 bactéries/champ pour pouvoir faire correctement cette mesure directement à partir du prélèvement ( Tableau 2 ). 3.2 Hémocultures Comme l'indique le Tableau 3 , il est possible de faire, directement à partir d'une hémoculture positive un antibiogramme par diffusion en gélose, reproduisant les conditions standard pour diverses espèces bactériennes. Néanmoins, la réussite de ce test n'est pas obtenue avec la même dilution du bouillon d'hémoculture pour toutes les espèces. La dilution 10 −4 est la dilution la plus fréquemment adéquate pour les bacilles à Gram négatif de type entérobactérie, tandis que la dilution 10 −2 est la plus fréquemment adéquate pour les cocci à Gram positif type staphylocoque et pneumocoque. Par ailleurs, pour cette dernière espèce, il faut utiliser la dilution 10 −1 pour mesurer correctement la CMI de la pénicilline G, de l'amoxicilline et du céfotaxime par la méthode du E-test directement à partir de l'hémoculture positive. 4 Discussion Les automates récemment mis sur le marché pour l'identification et la sensibilité des bactéries aux antibiotiques permettent de raccourcir le temps d'incubation requis pour la mesure de la sensibilité aux antibiotiques à partir d'une souche isolée. Selon la méthode utilisée pour détecter la croissance bactérienne (chimioluminescence, turbidimétrie, colorimétrie et fluorimétrie, laser-néphélométrie), le type d'antibiotique et le type de bactéries, le temps requis pour l'obtention du test de sensibilité varie de 3 à 12 heures [2–5] . Des délais du même ordre sont obtenus en faisant, cette fois, appel à la PCR quantitative en temps réel. Le principe de la méthode consiste à quantifier le gène codant l'ARN 16S ou le gène rpoB à partir de l'ADN bactérien extrait d'une culture (inoculum initial : Mcfarland 0,5) faite en présence de l'antibiotique utilisé à une concentration correspondant à la concentration critique basse [6] . Il faut toutefois noter, qu'à la différence des automates, la méthode par PCR en temps réel ne reste, pour l'heure, qu'une méthode expérimentale. Si on s'en tient aux automates et si on les replace dans le contexte d'un laboratoire de microbiologie clinique, il est clair qu'une bonne partie des résultats obtenus par les automates, notamment ceux obtenus dans les 12 heures suivant l'isolement de la souche, ne pourront être pris en compte pour la prescription d'antibiotiques que dans les 48 heures suivant le prélèvement, comme c'est le cas avec l'antibiogramme standard. L'intérêt de la méthode présentée dans cet article est que les résultats du test de sensibilité aux antibiotiques peuvent être réellement utilisés pour la prescription d'antibiotiques dès les 24 heures suivant le prélèvement tout en sachant que cela ne concerne pas tous les types de prélèvements mais seulement les liquides biologiques détectés, via l'examen microscopique du culot de centrifugation, infectés par un seul type de bactérie. Reste que s'il s'avère que le type de bactéries vu à l'examen microscopique (morphologie et coloration de Gram) est en fait constitué de deux espèces bactériennes (exemple deux types d'entérobactéries), l'antibiogramme obtenu, parce qu'il est fait par la méthode de diffusion en gélose, aura le mérite de faire apparaître le comportement global, c'est-à-dire le comportement des deux espèces confondues, vis-à-vis des antibiotiques. Il sera, néanmoins, nécessaire de mesurer dans un deuxième temps la sensibilité de chaque souche. Concernant les hémocultures, la littérature fait état d'études où le test de sensibilité aux antibiotiques a directement été fait à partir du bouillon d'hémoculture. Toutefois, comme ces tests ont été faits à l'aide d'automates pour identification et sensibilité aux antibiotiques [7–9] , des étapes préliminaires pour séparer les hématies des bactéries (centrifugations différentielles) et pour déterminer la taille correcte de l'inoculum bactérien ont été nécessaires. Les résultats de ces études, en dépit de l'utilisation d'une méthodologie commune, sont discordants. Pour Cueto et al. [9] , les tests de sensibilité obtenus directement à partir des hémocultures positives avec les automates ne sont pas fiables alors qu'ils le seraient pour Ling et al. [7] et Funke et al. [8] . Dans le présent travail qui utilise la méthode de diffusion en gélose, non seulement aucune étape préliminaire n'est requise pour éliminer les hématies, mais un inoculum correct a pu être standardisé au regard de la courbe de croissance des bactéries détectée par l'automate à hémoculture et au regard du type de bactéries vu à l'examen microscopique. C'est à notre connaissance la première étude qui fait état d'une méthode fiable et reproductible pour la mesure de la sensibilité aux antibiotiques des souches responsables de bactériémie directement à partir du bouillon d'hémoculture. En ne se posant plus la question de la sensibilité d'une souche aux antibiotiques mais celle de sa résistance, il a été proposé de s'affranchir de toutes les durées de temps nécessaires à la croissance bactérienne (isolement et inhibition de la croissance par les antibiotiques) en recherchant directement à partir du prélèvement et via des techniques de biologie moléculaire, le gène codant telle ou telle résistance. Les expériences les plus probantes ont porté sur la recherche du gène mec codant la résistance à la méticilline chez Staphylococcus aureus à partir de divers types de prélèvements [10–12] . Il est à noter que le portage nasal de S. aureus résistant à la méticilline est désormais détectable en une heure [12] . Pour que cette méthode de recherche de gène de résistance vienne se substituer au test de sensibilité aux antibiotiques dans les laboratoires de microbiologie clinique, il faudrait pouvoir rechercher en une seule expérimentation tous les types de gènes liés aux différents mécanismes de résistance vis-à-vis de toutes les familles d'antibiotiques habituellement testées. La mise à disposition de puces chargées de multiples empreintes génétiques devrait offrir cette possibilité. Il reste, toutefois, qu'avec ce type de méthode, la sensibilité d'une souche à tel ou tel antibiotique n'est que supputée, et son niveau de sensibilité (CMI) jamais déterminé. 5 Conclusion Bien que limitée aux espèces bactériennes les plus fréquentes, la mise au point rapportée dans cet article a l'avantage de montrer qu'il est possible de mesurer la sensibilité aux antibiotiques directement à partir de liquides biologiques infectés et d'hémocultures positives avec une qualité de résultats équivalente à celle obtenue dans les conditions standard [1] . Ce type de test ne peut, bien sûr, être appliqué qu'aux infections de liquides et aux bactériémies monomicrobiennes et, dans le cas des liquides infectés, qu'à ceux ayant une forte concentration bactérienne. Si ces deux conditions sont requises, la procédure proposée ne s'éloigne des pratiques habituellement appliquées dans le laboratoire de microbiologie clinique que par le recours à une cytocentrifugation pour les liquides biologiques infectés. Toutefois, cette procédure reste simple et permet de donner plus vite au clinicien, le lendemain du prélèvement et non plus le surlendemain, des informations quant à la sensibilité aux antibiotiques des bactéries. De ce gain de temps découle la possibilité de considérer plus rapidement la validité du traitement prescrit empiriquement chez les patients hospitalisés. L'autre avantage de cette technique est qu'elle peut être appliquée dans la plupart des laboratoires, notamment dans ceux qui ne disposent pas d'automate pour le test de sensibilité aux antibiotiques. Références [1] Comité de l'antibiogramme de la Société française de microbiologie Communiqué 2006 http://www.sfm.asso.fr [2] J.L. Donay D. Mathieu P. Fernandes C. Prégermain P. Bruel A. 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