PCR intracellulaire : nouvelle approche de diagnostic tissulaire et cytogénétique

Nous avons mis au point une technique de PCR in situ pour les gènes CD 34 et c-Kit dans des cellules mononucléées du sang périphérique humain. Après dépôt et fixation des cellules sur des lames, afin de faciliter la pénétration des réactifs nécessaire à la PCR, une perméabilisation des membranes est effectuée par traitement à la protéinase K. La PCR terminée, une hybridation in situ est réalisée en présence d'un oligonucléotide spécifique marqué à la digoxigénine. Ce marqueur ainsi lié au produit d'amplification est détecté par un anticorps antidigoxigénine marqué par la phosphatase alcaline. L'addition des substrats de cette enzyme (le nitro-bleu tétrazolium [NBT] et le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate [BCIP]) permet une révélation colorée en bleu-noir des cellulles dans lesquelles la PCR a été réalisée. Nous avons également montré que même dans le cas de cellules fixées sur lame, un contrôle de la réaction d'amplification juste après la PCR a été effectué. En effet, la perméabilisation des membranes cellulaires provoque une diffusion du produit d'amplification vers l'extérieur de la cellule. En prélevant après la PCR in situ le liquide réactionnel au-dessus des cellules, il est possible de visualiser par électrophorèse en présence de bromure d'éthidium le produit d'amplification.