梨小食心虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

[目的]本研究旨在探明梨小食心虫Grapholita molesta在不同发育阶段、成虫不同组织以及不同浓度的3种杀虫剂处理后成虫中稳定表达的内参基因,为后续对梨小食心虫目的基因表达的研究奠定基础.[方法]基于梨小食心虫转录组数据筛选10个候选内参基因(β-actin,18S rRNA,β-tubulin,EF-1α,RPL13,RPL32,RSPL40,UBC7,α-tubulin和RPS20);通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定候选内参基因在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢)以及不同浓度的3种杀虫剂(阿维菌素:19.819,72.897 和 179.663 μg/mL;吡虫啉:17.638,163.323 和 762.986 μg/mL 以及高效氯氟氰菊酯:33.791,96.123和198.282 μg/mL)通过玻璃管药膜法处理后成虫中的表达量;利用geNorm,NormFinder,△Ct,BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价.选择梨小食心虫细胞色素P450基因CYP354A32进行验证.[结果]结合qRT-PCR结果和软件评价结果表明,梨小食心虫不同发育阶段内参基因表达稳定性从高到低依次为β-tubulin,18S rRNA,EF-1α,RPL13,β-actin,RPS20,UBC7,RPL32,α-tubulin和RSPL40;成虫不同组织内参基因表达稳定性从高到低依次为 UBC7,β-tubulin,β-actin,18S rRNA,RSPL40,EF-1α,RPS20,RPL13,RPL32和α-tubulin;不同浓度阿维菌素、吡虫啉和高效氯氟氰菊酯处理后成虫中内参基因表达稳定性从高到低依次为 RPS20,RPL13,β-tubulin,β-actin,RPL32,RSPL40,EF-1 α,UBC7,α-tubulin 和18S rRNA.用所获得的内参基因组合对CYP354A2表达特性进行的分析结果表明,用β-tubulin,18S rRNA和EF-1α组合作为内参基因时CYP354A2在高龄幼虫及成虫中表达量较高,用UBC7,β-tubulin和β-actin组合作为内参基因时在成虫精巢和卵巢中有较高表达,且用RPS20,RPL13和β-tubulin组合作为内参基因时不同浓度杀虫剂处理后仅有19.819 μg/mL阿维菌素处理时CYP354A2表达量高于对照,其余浓度杀虫剂处理时CYP354A2表达量均低于对照.[结论]梨小食心虫不同发育阶段目的基因表达的研究推荐使用β-tubulin,18S rRNA和EF-1α组合作为内参基因;梨小食心虫成虫不同组织目的基因表达的研究推荐使用UBC7,β-tubulin和β-actin组合作为内参基因;不同浓度阿维菌素、吡虫啉和高效氯氟氰菊酯处理梨小食心虫成虫后目的基因表达的研究推荐使用RPS20,RPL13和β-tubulin组合作为内参基因.