人MR1/IgG1 Fc二聚体融合蛋白的构建、表达及功能检测

目的 构建MR1/IgG1 Fc融合蛋白杆状病毒表达载体并使其在昆虫细胞内表达获得MR1/IgG1 Fc二聚体,制备人工抗原提呈细胞用于黏膜相关恒定T细胞(MAIT)反应性代谢物及MAIT细胞功能调控研究.方法 从人外周血单个核细胞中扩增β2m编码基因.商业化合成MR1胞外段和IgG1 Fc融合基因的全序列基因MR1/IgG1 Fc,与β2m基因重组构建pFastBac™ Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]表达载体;利用Bac-to-Bac昆虫表达系统表达MR1/IgG1 Fc二聚体融合蛋白,并通过双抗体夹心ELISA、Western blot及流式细胞术进行检测.建立MR1/IgG1 Fc二聚体加载的人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cells,aAPCs),即MR1 aAPCs,提呈大肠埃希菌(DH5α)来源的代谢物,与人外周血单个核细胞共培养,检测MAIT细胞的活化和增殖水平.结果 经PCR及测序鉴定证实pFastBac™ Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]载体中MR1/IgG1 Fc与β2m具有正确序列.ELISA、Western blot及流式细胞术检测结果表明MR1/IgG1 Fc二聚体在重组杆粒感染的Sf9细胞培养上清富集,具有正确构象.加载DH5α来源代谢物的MR1 aAPCs能够促进MAIT细胞活化和增殖.结论 成功构建pFastBac™ Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]重组质粒,并在Sf9细胞中表达MR1/IgG1 Fc二聚体,制备获得MR1 aAPCs,为研究MAIT细胞反应性代谢物及MAIT细胞功能提供了新的工具.