Optimization of Colorimetric Assay of Loop Mediated Isothermal Amplification for Detections of Mycobacterium tuberculosis

การปรบปรงวธการตรวจแบบทำใหเกดสของวธ Loop Mediated Isothermal Amplification เพอตรวจหาเชอมยโคแบคทเรยม ทวเบอรควโลสส จตตนนท ศรสทศน1, อรณน สงกา2, วเศษ นามวาท3 1นกศกษาปรญญาโทสาขาวชาจลชววทยาทางการแพทย ภาควชาจลชววทยา คณะแพทยศาสตรมหาวทยาลยขอนแกน 2ภาควชาจลชววทยาคลนก คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยขอนแกน 3ภาควชาจลชววทยา คณะแพทยศาสตรมหาวทยาลยขอนแกน Background and objectives: Tuberculosis is an airborne disease caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB). It is a major public health problem of Thailand and worldwide, ranking as the second leading cause of death from worldwide infectious diseases. Diagnosis development is one of key factors to control it. The objective of this study was to optimize the colorimetric method of Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which is a new promising method because DNA is synthesized at a single temperature in relatively short period. Methodology: The LAMP was set-up to detect the genomic DNA of MTB. The amplified product was detected by using Hydroxy naphthol blue (HNB), Sybergreen (SYBR) and gel electrophoresis. The amount of HNB was optimized for detection compare to the results of using SYBR and gel electrophoreses. Results: Pre-addition of 5 mM HNB to the LAMP reaction solution showed observe-able blue-sky color of positive but did not interfere amplification efficiency. The minimum detection limit between using HNB, SYBR and gel electrophoresis were 10, 100 and 10 pg of MTB genomic DNA, respectively. Conclusion: The colorimetric LAMP method using HNB was successfully optimized for detection of MTB. The optimal of concentration of HNB was 5mM and the minimum detection limit was 10 pg of MTB genomic DNA which is similar to those of gel electrophoresis.   หลกการและวตถประสงค: วณโรคมสาเหตจากเชอมยโคแบคทเรยม ทวเบอรควโลสส (Mycobacterium tuberculosis) เปนปญหาหลกทางสาธารณสขของไทยและทวโลก นอกจากนยงเปนสาเหตการตายอนดบทสองของการเสยชวตจากโรคตดเชอทวโลก การพฒนาการตรวจวนจฉยวณโรคเปนปจจยสำคญอยางหนงในการควบคมวณโรค การศกษานมวตถประสงคเพอปรบการตรวจวดดวยสใหเหมาะสมทสดในขนตอนการตรวจวดหลงการเพมปรมาณ DNA ดวยเทคนค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ซงเปนวธทสะดวกและรวดเรวในการตรวจวนจฉย วธการศกษา: ไดใชเทคนค LAMP เพอใชในการตรวจหาดเอนเอของเชอ มยโคแบคทเรยม ทวเบอรควโลสส ในขนตอนการตรวจหาผลผลตของการเพมจำนวนดเอนเอ มการใช Hydroxy naphthol blue (HNB), Sybergreen (SYBR) และ gel electrophoresis มการปรบปรมาณและวธการใช HNB เปรยบเทยบผลจากการใช SYBR และ gel electrophoresis ผลการศกษา: การใช HNB ในการเตมลวงหนากอนปฏกรยาเพมจำนวนดเอนเอ ความเขมขนทเหมาะสมคอ 5 mM โดยผลบวกจะมการเปลยนสจากสมวงเปนสฟาและไมรบกวนปฏกรยา การตรวจหาปรมาณ DNA ของเชอ MTB ในระดบตำสด ระหวางการใช HNB, SYBR และ gel electrophoresis คอ 10, 100 และ 10 pg ตามลำดบ สรป: การตรวจแบบทำใหเกดสของวธ LAMP โดยใช HNB ไดรบการปรบใหเหมาะสมสำหรบการตรวจหาเชอMTB ความเขมขนทเหมาะสมของ HNB คอ 5mM และตรวจหาปรมาณ DNAของเชอ MTB ในระดบตำสดท 10 pg ซงคลายกบ gel electrophoresis Keywords: LAMP; Tuberculosis; HNB; Loop-Mediated; Isothermal; Amplification; Hydroxy naphthol blue คำสำคญ: วณโรค