脓毒症老年小鼠树突状细胞高尔基体应激和自噬水平变化及其对免疫功能的影响

目的 探究脓毒症状态下老年小鼠脾脏树突状细胞(dendritic cell,DC)功能状态的异常改变及其与高尔基体应激反应和自噬反应的内在联系.方法 不同年龄小鼠(青年鼠 8周龄,老年鼠18 月龄)分别随机分为假手术组与脓毒症模型组(CLP组)(n =4).CLP组小鼠于术后24h处死并取脾脏组织.采用免疫磁珠法分离纯化脾脏DC,流式细胞术检测各组DC表面标志物及共刺激分子(CD80、CD86、MHC-Ⅱ)表达水平.分离纯化不同年龄小鼠脾脏DC,各自分为空白对照组、LPS刺激组(1 μg/mL)(n =4).免疫印迹法检测各组细胞高尔基体应激反应相关蛋白——高尔基体磷蛋白 3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)、高尔基体重组堆积蛋白 2(Golgi reassembly stacking protein of 55 kDa,GRASP55)以及高尔基体自噬相关蛋白高尔基体蛋白亚家族A成员2(Golgi matrix protein,GM130)、微管相关蛋白 1A和 1B(microtubule-associated proteins 1A and 1B,MAP1LC3B)表达水平.激光共聚焦显微镜检测高尔基体红色荧光探针(Golgi-tracker Red)在各空白对照组中的显示情况.进一步应用抑制高尔基体蛋白转运的莫能菌素(monensin,MON)(1 μg/mL)预处理,检测扰乱高尔基体稳态对小鼠DC功能分化的影响.结果 与青年小鼠比较,老年脓毒症模型小鼠脾脏DC活化障碍显著.CLP术后 24h老年小鼠脾脏DC表面标志分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达升高水平明显低于青年小鼠(P<0.05).对比健康小鼠脾脏DC胞内高尔基体的结构功能状态发现,与青年小鼠比较,老年DC胞内高尔基体结构蛋白GRASP55、GM130 呈高表达(P<0.001),提示高尔基体结构肿胀;高尔基体外膜蛋白GOLPH3表达减弱(P<0.001),提示蛋白修饰及转运功能低下.分离提取不同年龄小鼠脾脏DC进行体外培养并给予LPS刺激,发现脓毒症老年小鼠DC胞内高尔基体应激反应增强、自噬明显,与DC功能障碍密切相关.给予MON抑制高尔基体蛋白转运,观察到青年、老年小鼠DC胞内高尔基体均发生显著应激与自噬反应,青年小鼠DC免疫功能活化障碍,老年小鼠功能障碍则更为显著.结论 老年小鼠DC中高尔基体结构肿胀且功能受损,造成DC免疫功能活化障碍,与老年脓毒症免疫抑制密切相关.