H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

[目的]真核表达H7 亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7 亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础.[方法]首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7 亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Western blots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBR green染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9 中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白.[结果]表达H7 亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9 内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约 70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7 亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于gp64 基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在 1×103～1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10 MOI的比例接种Sf9,孵育72 h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4 log2.[结论]本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIV HA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考.