单增李斯特菌Lm4b_02325基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为研究单增李斯特菌(LM)抗转录抑制因子编码基因Lm4b_02325对LM的生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建Lm4b_02325基因缺失株LM928△Lm4b_02325和回补株CLM928△Lm4b_02325并均经PCR和测序鉴定.同时采用PCR鉴定该菌的遗传稳定性.上述结果表明基因缺失株与回补株均正确构建,且缺失株的遗传稳定性较强.根据培养不同时间的OD600mm值绘制缺失株、回补株和亲本株的生长曲线;对小鼠腹腔注射不同浓度(109cfu/mL～105 cfu/mL)的3株菌,观察感染后小鼠的临床症状,统计死亡率并计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD50).以MOI 10将上述3种菌分别感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC),1 h后裂解各菌,10倍倍比稀释,并涂布于BHI固体培养基,37 ℃培养1 d后经菌落计数,分析各株菌对HBMEC的粘附力;按照上述方法感染各菌后1 h加入庆大霉素以及感染各菌后不同时间加入庆大霉素杀死未粘附的细菌,裂解各细菌,10倍倍比稀释并涂布于BHI固体培养基,通过菌落计数结果分析各菌株对HBMEC的侵袭力及在该细胞内的增殖能力.生长曲线结果显示3株菌的生长趋势基本相似.小鼠的致病性实验结果显示,接种109 cfu/mL～107 cfu/mL3株菌的小鼠出现被毛凌乱、厌食或神经症状与昏睡等临床症状,死亡率接近100％.而接种106 cfu/mL～105 cfu/mL 3株菌的小鼠临床症状较轻,死亡率较低.经计算LM928△Lm4b_02325对小鼠的LD50约105.45cfu/mL,毒力明显高于LM928株及CLM928△Lm4b_02325株(P＜0.05).粘附、侵袭力及胞内生存能力结果显示,黏附及侵入HBMEC的LM928△Lm4b_02325菌株数量极显著(P＜0.01)或者显著高于LM928(P＜0.01)与CLM928△Lm4b_02325株(P＜0.05);胞内存活试验结果显示,感染后各时间点LM928△Lm4b_02325较其余两种菌在HBMEC内的增殖速度均显著(P＜0.05)或者极显著(P＜0.01)加快,且前者在HBMEC中的存活数较后两者均显著(P＜0.05)或者极显著(P＜0.01)升高;采用荧光定量PCR(qPCR)检测黏附侵袭相关毒力基因inlA、inlB、inlC,胞内感染相关毒力基因plcA、plcB、actA、hly、mpl,内毒素调节基因prfA共9种毒力相关基因的转录水平,结果显示,LM928△Lm4b_02325株hly、mpl、inlC的转录水平显著降低(P＜0.05),actA、plcA的转录水平极显著下调(P＜0.01).其余基因转录水平均无显著变化.本研究结果首次表明Lm4b 02325基因缺失增强了LM对小鼠的致病性、对细胞的粘附性、侵袭力及胞内增殖能力,且其毒力基因hly、actA、plc A、mpl、inlA、inlC转录水平显著下调.本研究为Lm4b_02325基因的功能及在LM致病机致中作用的研究奠定基础.