CircCEP85L对牛肌肉干细胞增殖、成肌分化的调控

[目的]目前,越来越多的研究证明环状 RNA(circRNA)在牛肌肉发育过程中扮演着重要的角色,但其分子调控机理尚未完善.通过挖掘与牛肌肉发育相关的circRNA的作用机制,为进一步阐明其调控牛肌肉发育的分子机制奠定基础.[方法]以前期分析的增殖期(GM)与成肌分化期(DM)黄牛肌肉干细胞(MuSCs)的RNA-seq测序结果为基础,筛选出显著差异表达的 circRNA,circCEP85L.采集新鲜黄牛胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、肠和胃的组织样本,分离培养黄牛肌肉干细胞并诱导成肌分化,收集黄牛体外培养的GM与DM细胞,分别提取RNA并反转录为cDNA.通过实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)检测circCEP85L在不同组织及不同细胞状态的表达规律.同时,设计特异性引物扩增 circCEP85L 全长,构建过表达载体 p-circCEP85L,质粒转染 MuSCs 后收集过表达circCEP85L细胞样本.以过表达质粒pCD5-ciR细胞样本为对照,采用qRT-PCR、流式细胞术、Western Blot及免疫荧光等技术检测过表达 circCEP85L 对黄牛 MuSCs 增殖、凋亡及成肌分化的影响.[结果]PCR 电泳结果证明 circCEP85L环化位点真实存在.CircCEP85L在多种组织中表达,并在DM期的表达量显著高于GM期(P＜0.001);为了进一步探究对circCEP85L黄牛MuSCs的影响.将过表达载体p-circCEP85L与对照载体pCD5-ciR转染体外培养的黄牛MuSCs,继续培养 24 h之后,EdU结果表明过表达circCEP85L能显著降低EdU阳性细胞比例(P＜0.001);流式周期检测结果表明,过表达circCEP85L增加了G0/G1期细胞比例,显著减少S期细胞比例(P＜0.001);流式凋亡结果表明,过表达circCEP85L显著抑制MuSCs的凋亡率(P＜0.05).QRT-PCR及Western blot检测黄牛MuSCs增殖及凋亡相关基因的表达情况,结果表明过表达circCEP85L后显著降低了黄牛MuSCs增殖及凋亡相关基因的mRNA表达水平(P＜0.001),凋亡蛋白BAX的表达量也显著降低(P＜0.01).此外,为了检测过表达 circCEP85L对黄牛 MuSCs成肌分化的影响,在转染 24h后更换分化培养基诱导细胞分化,Western blot及免疫荧光结果显示过表达circCEP85L后显著促进分化标志基因MyH6的表达水平(P＜0.001),细胞融合形成肌管的数量和大小均显著高于对照组.[结论]研究表明,circCEP85L 通过抑制黄牛MuSCs增殖和凋亡、促进细胞成肌分化,从而影响黄牛骨骼肌的生长发育过程,为circRNA调控黄牛骨骼肌的生长发育机制研究奠定基础.