胰岛素降解酶突变体T142A的原核表达及其活性检测

目的 原核表达胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)突变体T142A,并检测其活性.方法 结合多序列比对结果和IDE底物共晶体结构,预测IDE的β6-strand结构中的活性残基.采用点突变技术将IDE的第142位苏氨酸替换为丙氨酸,构建重组质粒ppSUMO-T142A,通过E.coli系统表达后,经镍离子柱亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化,获得突变体T142A,荧光法测定其活性.结果 IDE氨基酸序列在16个物种间高度保守,T142直接参与底物结合,并与底物剪切位点相互作用,且靠近催化活性中心和门亚结构域等重要结构.经测序鉴定,证明重组质粒ppSUMO-T142A突变正确.表达的融合蛋白His-SUMO-T142A相对分子质量约131 000,主要以可溶形式存在于上清中,浓度为18 mg/mL;经3步纯化获得突变体T142A的纯度达86％.T142A催化降解荧光底物Substrate V的最大反应速率(Vmax)为501.06 min-1,米氏常数(Km)为9.01μmol/L,与野生型IDE(Vmax为2 814.32 min-1,Km为11.93 μmol/L)比较,活性大幅下降.结论 本研究表达的IDE突变体T142A活性大幅降低,T142是IDE发挥活性功能的重要残基,为新型IDE活性调控分子的研发提供了实验依据.