泛素E3连接酶CHIP介导RCC2的泛素化及降解

目的 本课题组前期构建了一种正交泛素传递方法,并发现染色体浓缩调节蛋白 2(RCC2)是泛素连接酶CHIP 的潜在底物.本实验旨在验证 CHIP 是否能介导 RCC2 的泛素化及降解,以期通过 CHIP 来泛素化调控 RCC2的表达和功能.方法 首先构建CHIP 及其突变体质粒,验证CHIP 与RCC2 是否有相互作用;然后构建 pLVX-RCC2-FLAG重组质粒并转染进 CHIP 敲减细胞株(shCHIP)、HEK293 细胞株、CHIP 过表达细胞株(OE CHIP),通过免疫共沉淀下拉富集 RCC2-FLAG并检测其泛素化水平;接下来在 HEK293 细胞中转染不同量的 CHIP,以及设置 CHX chase蛋白稳定性实验,检测 RCC2 的蛋白水平变化;最后利用泛素突变体 K48R-Ub 及 K11R-Ub 进行 CHIP 介导RCC2 上形成泛素链的实验检测.结果 在 HEK293 细胞中,CHIP 能够介导 RCC2 的泛素化,并在 RCC2 上形成 K48和 K11 多聚泛素链,促进其通过蛋白酶体发生降解.结论 泛素连接酶CHIP 能够介导RCC2 的泛素化及降解,为实现通过 CHIP 来泛素化调控 RCC2 提供了理论基础.