利用CRISPR/Cas9 技术构建Aff4 基因敲除B16-F10细胞系及AFF4的多克隆抗体制备

目的:利用CRISPR/Cas9 技术构建ALF转录伸长因子 4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10),自主制备特异的AFF4多克隆抗体.方法:设计一对分别靶向小鼠Aff4 基因第 3个外显子和第 4个内含子的向导RNA(sgRNA).将构建成功的重组质粒转染至B16-F10 细胞中,并利用抗性筛选出单克隆细胞,进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测.验证自主制备的AFF4 多克隆抗体的特异性.结果:通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系,其Aff4 基因mRNA水平(t=53.08,P<0.001)和AFF4蛋白表达水平(t=15.17,P<0.001)显著降低.免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4 多克隆抗体特异性良好(t=264.7,P<0.000 1).结论:成功构建了Aff4 基因敲除的B16-F10 稳定细胞系,并且成功制备抗AFF4 蛋白的多克隆抗体.