miR-296抑制自噬促进角膜新生血管生成

目的 本研究探讨miR-296在角膜新生血管生成中的作用以及其对自噬蛋白LC3B-Ⅰ/Ⅱ、p62的调控作用.方法 利用血管内皮生长因子诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立体外角膜新生血管模型.实验分为6组(Control 组、模型组、VEGF+miR-296 mimic NC 组、VEGF+miR-296 mimic 组、VEGF+miR-296 inhibitor NC组、VEGF+miR-296 inhibitor组).采用RT-qPCR检测miR-296在体外新生血管中的表达;转染过表达或者低表达miR-296,采用CCK-8、划痕实验、成管实验探究miR-296在体外角膜新生血管生成中的作用;采用KEGG和GO分析预测miR-296参与的通路及其靶基因的作用;采用Western blot检测miR-296对自噬蛋白LC3B-Ⅰ/Ⅱ、p62表达的影响.结果 RT-qPCR结果显示,与Control组相比,模型组中miR-296表达升高[(2.84±0.23)比(1.32± 0.04),t=6.42,P＜0.01];与 VEGF+miR-296 mimic NC 组相比,VEGF+miR-296 mimic 组细胞的 吸光度[(1.24±0.02)比(1.07±0.01),t=7.55,P＜0.05]、迁移数[(123.30±2.60)比(85.33±2.33),t=10.87,P＜0.01]、分支数[(128.70±2.73)比(107.30±1.20),t=7.16,P＜0.05]升高;与 VEGF+miR-296 inhibitor NC 组相比,VEGF+miR-296 inhibitor 组细胞的吸光度[(0.82±0.01)比(1.06±0.02),t=11.69,P＜0.05]、迁移数[(62.00± 1.16)比(84.33±1.8),t=10.59,P＜0.01]、分支数[(85.67±2.60)比(102.30±1.45),t=5.59,P＜0.05]降低;KEGG和GO分析预测了miR-296及其靶基因可能参与血管生成类通路和自噬水平的调控;western blot显示,与VEGF+miR-296 mimic NC组相比,VEGF+miR-296 mimic组细胞中LC3B-Ⅱ蛋白表达降低[(1.27±0.05)比(1.57±0.05),t=4.46,P＜0.05],p62 蛋白表达升高[(1.30±0.02)比(0.85±0.04),t=10.91,P＜0.01];相反,与VEGF+miR-296 inhibitor NC 组相比,VEGF+miR-296 inhibitor 组细胞中 LC3B-Ⅱ 蛋白表达升高[(2.37±0.01)比(0.04±0.03),t=11.78,P＜0.01],p62 蛋白表达降低[(0.52±0.02)比(0.85±0.03),t=9.24,P＜0.01].结论 miR-296在体外可促进角膜新生血管生成,且此过程与自噬水平的下调有关.