基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35 蛋白进行GCRV-VLPs的组装.实验将编码VP35 蛋白的GCRV-s11 基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTATM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35.将穿梭质粒 Bacmid-VP35 以及实验室前期构建的重组穿梭质粒 Bacmid-VP3、Bacmid-VP4 分别转染Sf9 昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3 以及pFHB-VP4.利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白的表达情况.结果显示,实验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的Sf9 昆虫细胞中正确表达.将成功表达蛋白的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3 以及pFHB-VP4 共感染Sf9 细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)观察VLPs的组装情况.结果显示,GCRV-Ⅱ的 3 个蛋白在Sf9 昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径为 65～72 nm.本实验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定了基础.