Développement, validation et mise en œuvre d’une méthode de dosage par CL-SM/SM des endocannabinoïdes plasmatiques

Dans le domaine médical, le système endocannabinoïde (SEC) est un sujet qui est d’actualité pour des raisons scientifiques et médiatiques (cannabis, cannabidiol…). Toutefois, la connaissance précise de ses rôles en situations physiologique ou pathologique demeure imparfaite. Depuis l’identification des récepteurs aux cannabinoïdes et de leurs ligands, de nombreuses études ont été menées pour comprendre les fonctions du SEC. Elles ont notamment permis de montrer l’implication du SEC dans les régulations de la balance énergétique au niveau central et périphérique, de la réponse au stress, de la plasticité cérébrale et dans les pathologies humaines notamment neurodégératives, psychiatriques et inflammatoires. L’objectif de ce travail de thèse était de (i) de réaliser l’état d’art des méthodologies de dosage des endocannabinoïdes et endocannabinoïdes-like, et (ii) de développer et de valider une méthode de dosage plasmatique de quatre molécules endocannabinoïdes et endocannabinoïdes-like (tels que AEA, 2-AG/1-AG, PEA et OEA). Pour développer cette méthode, notre fil conducteur a été la réalisation d’une revue bibliographique (sur la période de 2010 à avril 2022) sur les méthodes analytiques de dosage des endocannabinoïdes et endocannabinoïdes-like. Dans le volume de 100 μL d’échantillon plasmatique prélevé sur BD Vacutainer® K2E (EDTA) est ajouté 20 μL de solution d’étalon interne. L’extraction liquide-liquide est réalisée avec 800 μL de toluène. Après la centrifugation le surnageant est récupérés et séchés à température ambiante sous un flux d’azote. La récupération du résidu sec s’effectue avec 50 μL de méthanol et 10 μL est injecté dans le système CL-SM/SM. La méthode utilisant CL-SM/SM a été développée sur la base de ces recherches que nous avons adaptée et optimisée pour notre laboratoire et validée dans un environnement d’accréditation selon la Norme ISO 15 189. Les LLOQ obtenues dans le plasma pour le dosage de l’AEA, du 2-AG/1-AG, du PEA et de l’OEA sont de 0,1, 0,2, 0,5 et 0,5 μg/L, respectivement, avec une ULOQ de 15 μg/L. Cette méthode de dosage plasmatique des molécules endocannabinoïdes et endocannabinoïdes – like est aujourd’hui mise en œuvre dans le laboratoire dans le cadre de plusieurs protocoles de recherche clinique. Par ailleurs, nous avons également développée une méthode de dosage de ces mêmes quatre molécules (i) dans le sang total sur spots de sang séché sur buvard (ou Dried Blood Spots, DBS) de 10 μL (VAMS Mitra Neotéryx), et (ii) dans les cheveux. Au-delà des implications multiples du SEC, cette imperfection de compréhension repose surtout sur la difficulté analytique de son exploration. Les méthodes de dosage des endocannabinoïdes (et endocannabinoïdes-like) sont rares, chronophages et non appliquées en routine pour le moment. L’intérêt croissant du monde scientifique pour le SEC justifie ce travail et la place de cette méthode comme un outil important dans les recherches fondamentales et cliniques (diagnostic et suivi) futures.