反硝化细菌法测定土壤NO2--15N丰度的方法优化

NO2-是土壤中多个氮转化过程的关键中间产物,具有浓度低、转化快的特点.反硝化细菌法与质谱技术相结合,已广泛用于NO3-或NO2-的 15N同位素分析.本文旨在优化现有Stenotrophomonas nitritireducens反硝化细菌法的培养和反应条件,实现对土壤浸提液中NO2--15N丰度的专一、快速、准确测定.结果表明,使用种子液好氧摇培与单菌落微氧培养对NO2-样品的 15N同位素测定无显著差异,种子液可保证不同批次菌体的稳定性,好氧培养可将培养时间从7～8 d缩短至12～15 h.高纯N2或He气吹扫0.5 h均能有效去除O2 和空白杂质氮,但N2吹扫成本更低.转移N2O气体至干燥气瓶,不影响测定结果的准确性和精密度,还能延长样品保存时间,减少碱蒸汽腐蚀仪器管路.使用处于对数生长期的菌体,调节反应体系的菌体浓度OD600 值为0.3～0.9,可保证其反硝化效率,减少不同批次菌体的差异.使用不超过1 mol·L–1的KCl浸提土壤,既可保证提取效率,也能减少对菌体活力的影响.优化后的方法不仅能准确测定不同类型土壤中NO2-的 15N丰度,对5～20 nmol自然丰度NO2-的δ15N值测量精度为0.1‰～0.9‰,且大部分<0.5‰,还大幅简化了步骤、缩短了实验周期、节约了成本.