猫冠状病毒核衣壳蛋白的可溶性表达与多克隆抗体反应性鉴定

为制备猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白的特异性抗体,本研究将Ⅰ型FCoV(ZJU1709)的N蛋白基因全长cDNA亚克隆到pCold TF原核表达载体上,通过低温诱导表达、镍柱亲和纯化获得可溶性重组N蛋白;进一步以纯化的重组N蛋白为免疫原制备兔多克隆抗血清(多抗血清),再通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting,WB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)等多种方法对兔多抗血清进行反应性鉴定.结果显示:经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)和低温诱导,成功表达出分子量约为100 kDa的可溶性重组N蛋白,在非变性条件下亲和纯化获得的重组N蛋白质量浓度达到1.4 mg/mL;N蛋白兔多抗血清的ELISA效价可达1×106,与真核表达的重组蛋白Flag-N以及FCoV感染细胞中的N蛋白均具有良好的WB和IFA反应性.交叉反应性结果显示:该多克隆抗体能与α属冠状病毒中不同亚型的FCoV以及犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的N蛋白发生反应,但不与β属冠状病毒中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2,SARS-CoV-2)和γ属冠状病毒中的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的N蛋白发生反应.综上所述,以pCold TF原核系统表达的可溶性重组N蛋白具有良好的免疫原性,以该蛋白制备的FCoV N蛋白兔多抗血清能识别多种来自不同物种的α属冠状病毒N蛋白,但与β、γ属冠状病毒N蛋白没有交叉反应性,这为进一步研究FCoV复制机制以及开发高效的抗原和抗体检测技术奠定了基础.