基于Nanoluc技术和荧光分析技术建立蛋白质水解靶向嵌合体筛选方法及评价

目的 为了从一系列旨在降解靶蛋白的化合物中筛选出高效的蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC),本文建立了一个稳定的高通量PROTAC筛选方法.方法 Nanoluc荧光素酶有LgBiT和HiBiT两个亚基组成,通过将HiBiT标签与mCherry(红色荧光蛋白)、目的蛋白、Halo标签融合表达,LgBiT与GFP(绿色荧光蛋白)融合表达,利用GFP与mCherry的共定位情况可直观评价Nanoluc荧光素酶的组装情况,而通过监测Nanoluc的活性可以指示目的蛋白的含量.利用慢病毒包装系统构建稳定过表达GFP-LgBiT和HiBiT-mCherry-Target-Halo的细胞系,使用可募集Halo标签融合蛋白被Cul2-Rbx1-EloBC-VHL复合体降解的HaloPROTAC3诱导HiBiT-mCherry-Target-Halo降解,进一步利用蛋白质免疫印迹(Western blot)、Nanoluc荧光素酶活性分析系统和流式细胞术分别评价HaloPROTAC3诱导底物降解的效率.结果 HaloPROTAC3高效降解HiBiT-mCherry-Target-Halo,并呈现浓度和时间依赖性.结论 本文建立了一种联合Nanoluc技术和荧光分析的PROTAC筛选策略,用HaloPROTAC3作为阳性对照,可以快速评价PROTAC分子使底物蛋白被降解的效率,实现对PROTAC的"优化选择"或者"优中选优",为最终PROTAC的开发应用提供保障.